Name: three-dimensional imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization
Uploaded: 2019-10-29T14:30:00
Duration: 6 min 33 s
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हम इस विधि को विकसित करने में मदद करने के लिए Jeffrey Nguyen और यहोशू Shaevitz शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. अनुदान: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - ग्लेन उम्र बढ़ने अनुसंधान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन PHY-1734030 के लिए केंद्र.

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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम उच्च गुणवत्ता वाले छवियों के अधिग्रहण है. कोशिकाओं को ठीक से पुनर्निर्माण करने के लिए, सेल के ऊपर और नीचे पर्याप्त धुंधला होना चाहिए। इसलिए, यह जरूरी है कि z-स्टैक लिया एक बड़ी पर्याप्त दूरी को शामिल किया गया है. छवि अधिग्रहण के दौरान उठाए गए कदमों की संख्या प्रत्येक तनाव के लिए समायोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, रॉड के लिए नष्ट कर दी गई ई. कोलाई कोशिकाएं व्यापक होती हैं और उन्हें अधिक चरणों की आवश्यकता होती है, और इसलिए, जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में अधिक दूरी होती है। यदि नमूना छवि अधिग्रहण के दौरान drifts, पुनर्निर्माण प्रमुख त्रुटियाँ हो सकती है. इसलिए, स्लाइड को ज़-स्टैक अधिग्रहण के दौरान बहाव से बचने के लिए इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप के साथ थर्मल संतुलन में आने देना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को कम autofluorscence के साथ पैड पर छवि की जानी चाहिए. मीडिया घटकों, जैसे कि आम LB माध्यम में पाए जाने वाले घटकों में ऑटोफ्लोरेसेंस होता है जो कोशिकाओं के पुनर्निर्माण का प्रयास करते समय समस्याएं पैदा कर सकता है. इमेजिंग पैड पर कोशिकाओं का घनत्व महत्वपूर्ण है क्योंकि पुनर्निर्माण की प्रक्रिया प्रत्येक सेल पर स्वतंत्र रूप से किया जाता है. बहुत कम कोशिकाओं को कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या की छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय में वृद्धि होगी, जबकि बहुत सारे कोशिकाओं इमेजिंग क्षेत्रों है कि आसानी से व्यक्तिगत कोशिकाओं फसल के लिए बहुत घने हैं में परिणाम होगा. क्योंकि सभी कोशिकाओं को ठीक से पुनर्निर्माण नहीं, अतिरिक्त कोशिकाओं के अधिग्रहण कदम के दौरान छवि की जानी चाहिए और सभी outputs सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले जांच की जानी चाहिए (चित्र 3).
इस विधि के लिए सीमाओं के कई तकनीकी हैं. माइक्रोस्कोप पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए, एक एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर है कि एक उद्देश्य होना चाहिए (आमतौर पर gt; 1.4), क्योंकि यह बैक्टीरिया के आकार के पैमाने पर ऑप्टिकल अनुभागीय न्यर्द सक्षम बनाता है. इसके अतिरिक्त, माइक्रोस्कोप एक piezo चरण है कि z-दिशा में छोटे, सटीक कदम ले जा सकते हैं के साथ सुसज्जित करने की जरूरत है. इसके अलावा, जबकि यह आवश्यक नहीं है, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को चलाने के लिए उच्च थ्रूपुट अभिकलनीय संसाधनों तक पहुंच अत्यधिक अनुशंसित है क्योंकि यह कोशिकाओं के पुनर्निर्माण के लिए प्रसंस्करण समय को कम कर देगा।
विधि के लिए एक वैचारिक सीमा यह है कि छवियों के संकेत से शोर अनुपात के सापेक्ष पुनर्निर्माण की चिकनाई वजन के लिए सही ऊर्जा तराजू चुना जाना चाहिए. पैरामीटर के एक विकल्प को मान्य करने के लिए, आकार और कोशिकाओं के आकार ऐसे संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) के रूप में स्वतंत्र तरीकों का उपयोग कर मापा जाना चाहिए. सिद्धांत के एक सबूत के रूप में, कोशिकाओं के 3 डी पुनर्निर्माण या तो एक AFM पर प्रदर्शन किया गया z-accuracy के लिए परीक्षण करने के लिए (और lt;50 एनएम) या एक TEM ग्रिड पर xy-accuracy के लिए परीक्षण करने के लिए (और lt;30 एनएम)3. इस तरह के एक सहसंबद्ध दृष्टिकोण समय लगता है और महंगा है. एक सरल दृष्टिकोण छवि मानक नमूने जैसे जंगली प्रकार की कोशिकाओं या 1 डिग्री मीटर गोलाकार मोती के लिए हो सकता है. पुनर्निर्माण के व्यास और गोलाकार का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि पुनर्निर्माण में उपयोग किए जाने वाले आकार और ऊर्जा पैमाने सही हैं।
यह एकमात्र तरीका है कि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी छवियों से उच्च संकल्प स्थानिक जानकारी निकालने के लिए करना चाहता है नहीं है। कई समीक्षा लेख सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी24,25के क्षेत्र में हाल ही में प्रगति का वर्णन . संकल्प बढ़ाने की तकनीक जैसे deconvolution माइक्रोस्कोपी26, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी27, पिक्सेल पुन: असाइन28, और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम)29 के संकल्प में सुधार करने की तलाश माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत चित्र। इन विधियों प्रस्तुत प्रकिया के साथ असंगत नहीं हैं। हाल ही में इस विधि के लिए आदानों9के रूप में सिम आधारित छवियों के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया था. जबकि आगे कनवल्शन विधि deconvolution माइक्रोस्कोपी के साथ अपने underpinnings के कुछ शेयरों, यह एक पूरी तरह से अलग उत्पादन किया है. जबकि इस तरह के deconvolution माइक्रोस्कोपी के रूप में दृष्टिकोण छवि के संकल्प में सुधार करने के लिए चाहते हैं, इस दृष्टिकोण एक छवि उत्पन्न नहीं करता है बल्कि लगभग 50 एनएम परिशुद्धता के साथ एक सेल आकार पुनर्निर्माण. विरल लेबल नमूनों के आधार पर एकल अणु सक्रिय नियंत्रण माइक्रोस्कोपी तकनीक इस विधि की तुलना में स्थानिक परिशुद्धता के भी उच्च स्तर प्रदान कर सकते हैं। कई मामलों में, इन एकल अणु दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट constructs के अनुकूलन की आवश्यकता होती है और लंबे समय से अधिग्रहण बार की आवश्यकता कर सकते हैं, उन्हें जीना या गतिशील नमूने के साथ उपयोग करने के लिए मुश्किल बना. इन विधियों में से प्रत्येक एक या अधिक चेतावनी है कि इस विधि नहीं करता है के साथ आता है. उदाहरण के लिए, डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी कताई द्वारा विज्ञापित लाभ के रूप में जीवाणु कोशिकाओं के monolayers के लिए लागू नहीं हैं, जहां विमान प्रकाश से बाहर ज्यादा नहीं है. इसके अलावा, इस विधि किसी भी विशेष fluorores की आवश्यकता के बिना सटीक 3 डी सेल आकार और प्रोटीन स्थानीयकरण प्राप्त करने के लिए एक पाइप लाइन प्रदान करता है। इस विधि में न्यूनतम हार्डवेयर आवश्यकताएं हैं (यानी, z piezo, उच्च NA उद्देश्य) और केवल प्रति timepoint छवियों के दसियों की आवश्यकता है, एक आसानी से गतिशील 3 डी संरचनाओं की जांच करने के लिए अनुमति देता है6.
3 डी संरचनाओं में जीवाणु कोशिकाओं के संगठन का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण की संख्या में वृद्धि हुई है। इनमें संकल्पनात्मक दृष्टिकोण भी शामिल हैं जो उच्च गुणवत्ता , 3 डी फ्लोरोसेंट छवियों30,31,32का लाभ उठाते हैं . इस दृष्टिकोण अच्छी तरह से अलग कोशिकाओं की आवश्यकता है और सेलुलर ज्यामिति के बारे में कोई एक प्राथमिकता मान्यताओं बनाता है. तथापि, सघन कोशिकीय समुच्चय अथवा जैव-फिल्मों में जाने के लिए कोशिकाओं को छड़ की तरह माना जाता है। यह कम संकल्प दृश्य अभी भी कोशिकाओं की पैकिंग व्यवस्था की जांच में सक्षम बनाता है, हालांकि biofilm में कोशिकाओं के उच्च घनत्व विशिष्ट कारकों के subcellular स्थानीयकरण के विश्लेषण को रोकता है.
भविष्य में, यह इस 3 डी पुनर्निर्माण तकनीक के साथ एकल अणु और व्यापक क्षेत्र दृष्टिकोण को एकीकृत करने के लिए एक रूपरेखा विकसित करने के लिए दिलचस्प हो सकता है. इसके अलावा, अधिक घने सेल समूहों के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए मशीन दृष्टि विभाजन उपकरण32 के साथ इस आगे कनवल्शन दृष्टिकोण को शामिल करना संभव हो सकता है।
क्यों कोशिकाओं विशिष्ट आकार में विकसित एक जटिल मुद्दा है कि जटिल वातावरण में वे रहते हैं प्रतिबिंबित करना चाहिए है. विकास और सेल आकार के समारोह को समझना उन आकृतियों का सटीक और सटीक माप लेने की आवश्यकता है, जो है कि इस विधि क्या प्रदान करता है.

सभी प्रकार के कोशिकाएँ विशिष्ट कार्यों के लिए उनकी आकृतियों को विनियमित करती हैं। उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स रक्त कोशिकाओं की तुलना में अलग आकार के होते हैं और विभिन्न कार्य किया है. इसी प्रकार, जीवाणु कोशिकाएं विभिन्न आकारों और आकारों में आती हैं, यद्यपि इन आकृतियों का उद्देश्य हमेशा 1,2ज्ञातनहीं होता है। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि जीवाणु कोशिकाओं के आकार को सही ढंग से निर्धारित किया जाए। उल्लिखित विधि सबसे लाइव या निश्चित जीवाणु कोशिकाओं के 3 डी विश्लेषण के लिए उपयुक्त डेटा एकत्र करने के लिए एक आसानी से लागू करने का तरीका दिखाती है।
विधि वर्णित एक सही नमूना के 3 डी सेल आकार का प्रतिनिधित्व करने के लिए और ठीक इन आकृतियों के भीतर प्रोटीन स्थानीयकृत करने के लिए आदेश में जीवाणु कोशिकाओं के 3 डी छवियों लेने के लिए सक्षम बनाता है। पारंपरिक माइक्रोस्कोपी तकनीक 2 डी छवियों को ले, जो समस्याग्रस्त है जब कोशिकाओं है कि असामान्य या nonsymmetrical आकार है, इस तरह के Escherichia कोलाईके उत्परिवर्ती के रूप में अध्ययन, या ऐसे Vibrio हैजे और Helicobacter के रूप में घुमावदार बैक्टीरिया पिलोरी| उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी छवियाँ इस विधि के लिए कुंजी इनपुट हैं, जबकि विधि एक संकल्प-एन्हांस्ड छवि वापस नहीं करता है। इसके बजाय, यह विधि सक्रिय आकृति और सूक्ष्मदर्शी3 (चित्र 1)के स्पष्ट धुंधला फलन का उपयोग करके आगे कनवल्शन एल्गोरिथ्म का उपयोग करके 3D सतह निर्देशांकों और आकार का पुनर्निर्माण करती है। यह ई. कोलाई4,5,6,7, वी हैजा 8में उपन्यास periskeletal तत्व CrvA में जीवाणु actin homolog MreB अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है , और putative हेलिकोबैक्टर पाइलोरी9 मेंबैक्टोफिलिन सी.सी.एम.ए.
प्रोटीन के स्थानीयकरण उनके कार्यों में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं. उदाहरण के लिए कोशिका विभाजन में लगे प्रोटीनों को सामान्यतः मध्य कोशिका10,11में स्थानीयबनाया जाता है। जीवाणु के सभी प्रोटीनों को अपने कार्यों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की आशा में उच्च-थ्रूपुट अध्ययन किए गएहैं. दुर्भाग्य से, इन अध्ययनों 2 डी इमेजिंग और 1 डी या 2 डी विश्लेषण के साथ प्रदर्शन किया गया, यह असंभव प्रोटीन स्थानीयकरण के विशिष्ट पहलुओं को मापने के लिए कर रही है, इस तरह सेलुलर ज्यामितीय सुविधाओं के लिए स्थानीयकरण के रूप में.
उदाहरण के लिए, MreB, एक गतिशील प्रोटीन कई बैक्टीरिया की छड़ आकार के लिए आवश्यक है, कोशिका दीवार संश्लेषण के स्थानीयकरण निर्देशन द्वारा काम करने के लिए hypothesized है, और इसके स्थानीयकरण सेल दीवार संश्लेषण के स्थानीयकरण दर्पण7,13. कई प्रजातियों से MreB ज्यामितीय संवर्धन4,6,7,14,15से पता चलता है . गतिशील सतह बहुलक, जैसे MreB, समय औसत संवर्धन प्रोफ़ाइल16 करने के लिए सतह की ज्यामिति जोड़ी और झिल्ली17के लिए बाध्यकारी के साथ जुड़े ऊर्जा को कम करके विशिष्ट geometries के लिए उन्मुख करने में सक्षम हो सकता है. जबकि घुमा, बंडलिंग, झुकने, और गतिशीलता के महत्व को पूरी तरह से MreB के लिए हल नहीं किया गया है, यह ध्यान दें कि एक सतह के दोनों प्रमुख curvatures के सटीक माप सेल का एक पूर्ण 3 डी प्रतिनिधित्व की आवश्यकता है महत्वपूर्ण है. इसलिए, सबसे सही curvatures जो प्रोटीन स्थानीयकरण को मापने के लिए, यह 3 डी का उपयोग करने के लिए अधिमानी है, बजाय 2 डी इमेजिंग. 3 डी इमेजिंग computationally उन curvatures जो 2 डी में मापा नहीं जा सकता है का अनुमान लगाने की जरूरत समाप्त, एक अनुमान है कि असममित कोशिकाओं में सही नहीं हो सकताहै 18.
हालांकि कोशिकाओं की 2 डी इमेजिंग तेज है और के रूप में ज्यादा postimaging कम्प्यूटेशनल काम की आवश्यकता नहीं है, 3 डी इमेजिंग सेल का एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, साथ ही इस तरह के वक्रता के रूप में सतह सुविधाओं को मापने की क्षमता, जो 2 डी में नहीं मापा जा सकता है. इसलिए, के रूप में 3 डी इमेजिंग और अधिक आम हो जाता है, सेल आकार और प्रोटीन स्थानीयकरण में नई अंतर्दृष्टि संभव हो जाएगा.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50nm fluorescent beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td>these are used to measure the blurring function of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>Puritan Medical Products Company LLC</td>
			<td>S304659</td>
			<td>used to appy VaLaP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>used to cro cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LST3166</td>
			<td>membrane dye used to stain cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>Huygens essential or professional</td>
			<td>Use to measure blurring function of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7387</td>
			<td>combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB growth medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 medium</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>M1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Needed to run forward convolution scripts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nkon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Equate</td>
			<td>49035-038-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezo z stage</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77011589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet tips -p200</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet tips- p10</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization

जीवाणु का आकार इसके शरीर क्रिया विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण है। सेल फिजियोलॉजी के कई पहलुओं जैसे सेल गतिशीलता, predation, और biofilm उत्पादन सेल आकार से प्रभावित किया जा सकता है. जीवाणु कोशिकाओं तीन आयामी (3 डी) वस्तुओं रहे हैं, हालांकि वे शायद ही कभी इस तरह के रूप में इलाज कर रहे हैं. अधिकांश माइक्रोस्कोपी तकनीकों के परिणामस्वरूप दो आयामी (2 डी) छवियों का परिणाम वास्तविक 3 डी सेल आकार और प्रोटीन के स्थानीयकरण से संबंधित डेटा की हानि हो जाती है। कुछ आकार पैरामीटर, जैसे गाऊसी वक्रता (दो प्रमुख वक्रता के उत्पाद), केवल 3 डी में मापा जा सकता है क्योंकि 2 डी छवियों दोनों प्रमुख curvatures उपाय नहीं है. इसके अतिरिक्त, नहीं सभी कोशिकाओं फ्लैट झूठ जब बढ़ते और 2 डी घुमावदार कोशिकाओं की इमेजिंग सही इन कोशिकाओं के आकार का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है. 3 डी में प्रोटीन स्थानीयकरण को मापने से स्थानिक विनियमन और प्रोटीन के समारोह का निर्धारण करने में मदद मिल सकती है। एक आगे कनवल्शन तकनीक विकसित की गई है जो 3 डी सेल आकृतियों के पुनर्निर्माण और प्रोटीन को सही रूप से स्थानीयकृत करने के लिए माइक्रोस्कोप के धुंधला समारोह का उपयोग करती है। यहाँ, तैयार करने और 3 डी में बैक्टीरिया के लाइव सेल इमेजिंग के लिए नमूने बढ़ते दोनों एक सटीक सेल आकार के पुनर्निर्माण के लिए और प्रोटीन स्थानीयकृत करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. विधि सरल नमूना तैयारी, फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण, और MATLAB आधारित छवि प्रसंस्करण पर आधारित है. कई उच्च गुणवत्ता फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप बस इन माप लेने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इन सेल पुनर्निर्माण computationally गहन कर रहे हैं और उच्च throughput कम्प्यूटेशनल संसाधनों के लिए उपयोग की सिफारिश की है, हालांकि आवश्यक नहीं है. इस विधि को सफलतापूर्वक कई जीवाणु प्रजातियों और उत्परिवर्ती, फ्लोरोसेंट इमेजिंग रूपरेखा, और माइक्रोस्कोप निर्माताओं के लिए लागू किया गया है।

जीवाणु विभिन्न प्रकार के आकार और आकार में आते हैं जो उनके कार्यों कोप्रकृति1 में निर्धारित कर सकते हैं . इस प्रक्रिया का परिणाम छवियों के एक z-स्टैक के आगे convolution से कोशिकाओं का एक सटीक 3 डी प्रतिनिधित्व है (चित्र 1)। घुमावदार कोशिकाओं (चित्र 2) या असामान्य रूप से आकार की कोशिकाओं (चित्र 4ए) के साथ , क्योंकि 2D प्रतिनिधित्व कोशिकाओं की वक्रता को सही ढंग से प्रतिबिंबित नहीं करता है , तो यह विधि विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अग्रकन संवलन विधि (चित्र 1ए) का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को या तो परिधीय रूप से दागदार होना चाहिए या एक साइटोप्लाज्मिक दाग होना चाहिए (चित्र 2बी बाएं बनाम दाएँ)।
चित्र 4 कक्ष में MreB स्थानीयकरण दिखाता है। एक GFP संलयन जीवाणु actin प्रोटीन MreB21 के लिए बनाया गया था ताकि दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ई. कोलाई कोशिकाओं में अपने सटीक स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए4. क्योंकि MreB झिल्ली के साथ जुड़ा हुआ है, 3 डी इमेजिंग ईमानदारी से सेल में अपनी स्थिति को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक है. 3 डी में इन माप बनाने के द्वारा, हम दोनों जंगली प्रकार और छड़ उत्परिवर्ती कोशिकाओं के आकार का पुनर्निर्माण करने में सक्षम थे (चित्र 4ए). MreB के स्थानीयकरण छोटे गॉसियन curvatures, एक ज्यामितीय सुविधा है कि केवल 3 डी में मापा जा सकता है पर समृद्ध होना दिखाया गया था, एक रॉड पर निर्भर तरीके से (चित्र 4बी).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig1.jpg"> चित्र 1: आगे कनवल्शन विधि कोशिका आकार का कोई पूर्व ज्ञान के साथ कोशिकाओं का पुनर्निर्माण करती है। (ए)विधि का अंतिम निर्गत एक 3D सेल पुनर्निर्माण है जो सूक्ष्मदर्शी के अंशांकित धुंधला फलन के साथ परीक्षण आकार की तुलना करके व्युत्पन्न होता है। यह मनाया z-स्टैक के साथ तुलना की है जब तक मनाया 3 डी छवि काल्पनिक एक से मेल खाता है. यहाँ दिखाया छवि एक सी वर्धमान सेल के पुनर्निर्माण का एक प्रतिपादन है. (ख)पुनर्निर्माण पाइप लाइन पुन: प्रेक्षित छवि स्टैक के आधार पर सतह तत्वों की अनुमानित स्थितियों को अद्यतन करता है। विधि की पूर्ण एल्गोरिथम विवरण के लिए, Nguyen3देखें. (ग)पुनर्निर्माण पाइपलाइन सेल के आकार की कोई प्राथमिकता ज्ञान के साथ शुरू होती है और प्रेक्षित z-स्टैक से मेल खाने के लिए सतह वर्टिक्स की स्थिति और संख्या को अपडेट करती है। 3 डी पुनर्निर्माण के दौरान हर 30 कदम से प्रतिनिधि छवियों एक वी हैजे सेल के तीन अलग अलग कोणों से दिखाया गया है. इस आकृति की सतह की स्थिति नकली और मनाया ढेर के बीच अंतर को कम करने के लिए अद्यतन किया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig2.jpg"> चित्र 2: प्रतिनिधि तीन अलग अलग आकार जीवाणु प्रजातियों के पुनर्निर्माण. तीन आयामी पुनर्निर्माण उनकी झिल्ली दाग (बाएं) के साथ कोशिकाओं से बनाया जा सकता है या एक साइटोप्लाज्मिक फ्लोरोफोर (दाएं) से भरा. प्रारंभिक कोशिका का आकार और वक्रता महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि एक मुड़ी हुई छड़, मुड़ी हुई छड़, या सीधी छड़ सभी सही ढंग से पुनर्निर्माण करने में सक्षम हैं। पुनर्निर्माण सतहों सतह के स्थानीय गाऊसी वक्रता के आधार पर रंग का कर रहे हैं। स्केल बार ] 1 $m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig3a.jpg"> चित्र 3: Reconstructions एकाधिक कारणों के लिए विफल कर सकते हैं। कोशिकाओं को यह सुनिश्चित करने के लिए जांच की जानी चाहिए कि पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म एक उचित परिणाम के लिए अभिसरित। बाएँ - प्रतिनिधि जंगली प्रकार (ऊपर) और रॉड] उत्परिवर्ती (नीचे) ई. कोलाई कोशिकाओं है कि गुणवत्ता नियंत्रण पारित कर दिया है. राइटजेड सेल जो ठीक से पुनर्निर्माण करने में विफल रहे और गुणवत्ता नियंत्रण पास नहीं कर पाए। विफल अभिसरण के पांच वर्गों दिखाया जाता है: (i) कोशिकाओं है कि फसल क्षेत्र के किनारे के बहुत करीब हैं एक तेज सीमांकन के लिए अग्रणी, (ii) कोशिकाओं है कि बहुत एक और सेल के करीब हैं, (iii) कोशिकाओं है कि एक divot का उत्पादन किया, (iv) कोशिकाओं है कि पिछले प्रारंभिक s आगे बढ़ना नहीं था tarting बिंदु, और (v) अन्य अज्ञात त्रुटियाँ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig4.jpg"> चित्र 4: विशिष्ट सेलुलर geometries के लिए प्रोटीन स्थानीयकरण दिखा प्रतिनिधि डेटा. (ए)जंगली प्रकार और छड़ ई. कोलाई कोशिकाओं की तीन आयामी पुनर्निर्माण कोशिकाओं को गाऊसी वक्रता और MreB फ्लोरोसेंट तीव्रता के साथ प्रदर्शित किया. स्केल बार ] 1 डिग्री मी. (बी) जंगली प्रकार और रॉड से MreB के संवर्धन भूखंडों ई. कोलाई कोशिकाओं. मान और मूल्य संवर्धन और मूल्यों को दिखाते हैं;1 सेल के समान कवरेज के सापेक्ष इन सेलुलर क्षेत्रों से MreB की कमी दिखाते हैं। छायादार क्षेत्रों मतलब मतलब से संकेत मिलता है $90% बूटस्ट्रैप विश्वास अंतराल मतलब है. प्रत्येक विकृति के लिए वक्र एक घन मसृणन spline है और p gt; 5 x 10-3के चरम वक्रता के लिए एक प्रायिकता सीमा का उपयोग कर काट दिया है. यह आंकड़ा से संशोधित किया गया है (Bratton एट अल.) 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

इस प्रोटोकॉल कैसे तैयार करने के लिए और जीने के लिए जीवाणु नमूने माउंट तीन आयामी इमेजिंग और कैसे उन छवियों से ई. कोलाई के तीन आयामी आकार के पुनर्निर्माण के लिए बताते हैं.

सटीक सेलुलर प्रतिनिधित्व और सटीक प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं के तीन आयामी इमेजिंग

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

क्योंकि बैक्टीरिया इतने छोटे होते हैं, लोग अक्सर भूल जाते हैं कि वे त्रि-आयामी वस्तुएं हैं। हमारा प्रोटोकॉल फ्लैट और घुमावदार कोशिकाओं दोनों के आकार के सटीक पुनर्निर्माण की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल में केवल एक मानक माइक्रोस्कोप में मामूली संशोधनों की आवश्यकता होती है और वे मैटलैब लिपियों में आसानी से उपलब्ध होते हैं।प्रयोग शुरू करने से पहले एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड के विपरीत सिरों पर तीन 20 से 20 मिलीमीटर कवर स्लिप में से प्रत्येक के दो ढेर रखें। पिपेट 200 माइक्रोलीटर एगर उठे पैड समाधान के स्लाइड पर और तुरंत और दृढ़ता से कवर स्लिप के ढेर पर एक दूसरी स्लाइड जगह के लिए agarose समतल । आग को कमरे के तापमान पर लगभग एक मिनट तक जमना करने की अनुमति देने के बाद ध्यान से शीर्ष स्लाइड को स्लाइड करें और जेल से व्यक्तिगत पांच मिलीमीटर व्यास पैड को काटने के लिए 200 माइक्रोलीटर पिपेट टिप के एक बड़े सिरे का उपयोग करें।जब सभी पैड ों को किसी भी सेल झुरमुटों को बाधित करने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को प्रत्येक पैड पर उपसंस्कृति के एक माइक्रोलीटर को जोड़ने से पहले सजातीय रूप से वितरित किया जाता है, तो ई.कोलाई सेल संस्कृति को कई बार पिपेट प्राप्त किया गया है। नमूनों को पांच से 10 मिनट के लिए सूखी हवा देने के बाद पुष्टि करते है कि बूंदों पूरी तरह से पैड पर एक कवर पर्ची रखने से पहले पैड में अवशोषित कर लिया गया है । फिर कवर स्लिप के किनारे के चारों ओर एक उपयुक्त सीलेंट को ब्रश करने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें, सीलेंट को कवर स्लिप के ऊपर से दूर रखने का ख्याल रखें।कवर स्लिप को सील करने के तुरंत बाद स्लाइड को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें और थर्मल संतुलन के पांच मिनट के बाद माइक्रोस्कोप फोकस पहियों का उपयोग करें ताकि सेल के बीच को ध्यान में लाया जा सके। ND अधिग्रहण के तहत संबद्ध माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में, जेड बॉक्स की जांच करने के लिए एक जेड स्टैक प्राप्त करने और शुरुआती बिंदु के रूप में सेल के बीच सेट करने के लिए होम बटन पर क्लिक करें । स्टेप साइज को 0.1 माइक्रोमीटर और रेंज को चार माइक्रोमीटर पर सेट करें और सुनिश्चित करें कि जेड डिवाइस पीजो स्टेज पर सेट है।यह महत्वपूर्ण है कि कोशिका के ऊपर और नीचे दोनों पर पर्याप्त धुंधला है ताकि कोशिका पृष्ठभूमि से लगभग अविवेच्य हो। फ्लोरोसेंट अणुओं को इमेज किए जाने के लिए सेटिंग्स के लिए लैम्ब्डा विंडो के नीचे फ्लोरोसेंट चैनल सेट करें और पुष्टि करें कि प्रयोग का क्रम लैम्ब्डा के लिए सेट किया गया है ताकि स्विच करने से पहले प्रत्येक रंग चैनल में एक पूर्ण जेड स्टैक प्राप्त किया जा सके। फिर छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए अब रन पर क्लिक करें।जब सभी छवियों का अधिग्रहण किया गया है एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में फ़ाइलों को खोलें। एक व्यक्तिगत सेल के चारों ओर एक बॉक्स ड्रा और डुप्लिकेट कि सेल दो बार, प्रत्येक चैनल के लिए एक बार, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डुप्लिकेट हाइपरस्टैक बॉक्स की जांच की जाती है, और चैनल को एक या दो में बदल दें। एक बार जब दोनों ढेर उपलब्ध हो जाते हैं, तो छवियों को संयोजित करने के लिए छवियों, स्टैक, टूल्स और कॉन्टेनेट का चयन करें।प्रोटीन चैनल के साथ पहले और आकार चैनल दूसरा। एक झगड़ा फ़ाइल के रूप में नई छवि को बचाने के बाद डेस्कटॉप पर एक फ़ोल्डर के अंदर एक फ़ोल्डर बनाते हैं जिसमें फसली छवियां और cell_shape_settings_tri होते हैं। shae-cellshape-सार्वजनिक exampleData_tri से txt फ़ाइल ।cell_shape_settings_tri को संपादित करें। टेक्सट फ़ाइल में रुचि के प्रयोग के लिए सही सेटिंग्स हैं। और Cell_shape_detector3dConvTriFolder फ़ंक्शन को स्ट्रिंग के साथ फ़ंल्डर स्थान पर चलाएं जिसके बाद सेल की संख्या शुरू होनी चाहिए और कोशिकाओं की संख्या जिसे चलाया जाना चाहिए।इस बात की पुष्टि करने के लिए कि कोशिकाओं को रन स्क्रीनफिट्स को ठीक से खंगाला गया है। जब ग्राफिकल यूजर इंटरफेस खुलता है तो चुनिंदा फ़ोल्डर बटन पर क्लिक करें और व्यक्तिगत सेल पुनर्निर्माण को नेत्रहीन रूप से स्क्रीन करने के लिए पुनर्निर्माण डेटा फ़ाइलों के साथ फ़ोल्डर का चयन करें। किसी भी सेल के लिए जो गलत प्रतीत होता है या जिसमें पूर्ण कवरेज का अभाव है, नाम पर उपांग ध्वज के पुनर्निर्माण के बगल में बॉक्स का चयन करें ताकि इसे किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से बाहर रखा जा सके।सतह पर गॉसियन वक्रता के कार्य के रूप में ब्याज के प्रोटीन की सापेक्ष एकाग्रता का एक संवर्धन प्रोफ़ाइल बनाने के लिए संवर्धनस्मोथिंगस्लाइन चलाएं। फिर बस-निर्मित टीआरआई के साथ प्रत्येक फ़ोल्डर का चयन करें। चटाई फ़ाइलें और नव निर्मित वक्र चटाई फ़ाइल का चयन करें।यह विधि विशेष रूप से उपयोगी है जब घुमावदार या असामान्य रूप से आकार की कोशिकाओं से निपटने के रूप में एक 2 डी प्रतिनिधित्व कोशिकाओं की वक्रता को सही ढंग से प्रतिबिंबित नहीं कर सकते । इस प्रयोग में जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ई कोलाई कोशिकाओं दोनों में ऐक्टिन प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए बैक्टीरियल ऐक्टिन प्रोटीन एमआरईबी के लिए एक हरे फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन किया गया था। 3 डी में इन मापों को कैप्चर करके जंगली प्रकार और रॉडज़ उत्परिवर्ती कोशिकाओं दोनों के आकार को खंगाला जा सकता था।MreB के स्थानीयकरण तो छोटे गॉसियन वक्रता, एक ज्यामितीय सुविधा है कि केवल एक rodZ निर्भर तरीके से 3 डी में मापा जा सकता है पर समृद्ध होने के लिए निर्धारित किया गया था । यह सुनिश्चित करना याद रखें कि जेड स्टैक काफी बड़ा है कि कोशिकाएं ऊपर और नीचे धुंधली हैं और कोशिकाएं एक दूसरे से अच्छी तरह से दूरी पर हैं। हम दिखा रहे हैं कि 3 डी में प्रोटीन के ज्यामितीय स्थानीयकरण को कैसे मापना है लेकिन अन्य जानकारी की गणना इस डेटा से की जा सकती है जैसे टैग प्रोटीन असेंबली का आकार।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomatal रिस्पांस मूल्यांकन लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं पूरी पत्ती इमेजिंग का उपयोग

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

लार लार ग्रंथि, Ixodes Scapularis Ticks से और Hemolymph संग्रह

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent बैक्टीरियल इमेजिंग<em&gt; Vivo में</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Photoactivated एकल अणु ट्रैकिंग का प्रयोग लाइव बैक्टीरियल कोशिकाओं में प्रोटीन डीएनए बातचीत Visualizing

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में कार्यात्मक बैक्टीरियल effectors के electroporation

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

सेलुलर भेदभाव और सिंगल सेल इमेजिंग का प्रेरण<em&gt; विब्रियो परहामोलीटिकस</emतैरने वाला और स्वांबर कक्ष

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

बेहद मल्टीप्लेक्जड, सुपरस्टोयलिंग इमेजिंग टी सेल

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के तीन आयामी दृश्य के लिए हल्की चादर माइक्रोस्कोपी

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

तीन आयामी मात्रात्मक चरण इमेजिंग और मशीन लर्निंग का उपयोग करके लिम्फोसाइट उपप्रकारों की लेबल-मुक्त पहचान

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...