Name: three-dimensional imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization
Uploaded: 2019-10-29T14:30:00
Duration: 6 min 33 s
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Gostaríamos de agradecer a Jeffrey Nguyen e Joshua Shaevitz por ajudarem a desenvolver este método. Financiamento: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - Glenn Centers for Aging Research e National Science Foundation PHY-1734030.

1. Preparação da amostra
<ol><li>Faça E. coli fluorescente para a imagem, quer por engenharia-los para expressar uma proteína fluorescente citoplasma6 ou usando um corante de membrana5. Outras espécies bacterianas podem ser usadas em vez de E. coli.<ol>
<li>Transforme as células através da eletroporação com um plasmídeo que codifica a proteína fluorescente mCherry citoplasmática. Nota: Diferentes proteínas fluorescentes de outras cores podem ser usadas.</li>
		<li>Crescer os transformadores em uma placa LB com o antibiótico apropriado em 37 °C. Obter colônias individuais e identificar clones positivos por microscopia. Colônias resistentes a antibióticos que aparecem vermelhas o microscópio contêm o plasmite carregando mCherry.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crescer 2 mL da cultura durante a noite em mídia líquida LB com os antibióticos adequados em 37 ° C em uma incubadora tremendo. Use uma colônia de uma placa ou uma pequena quantidade de um estoque do congelador como o inoculum. Nota: Use os meios necessários para as pilhas bacterianas selecionadas para a experiência.</li>
	<li>Subcultura a cultura durante a noite 1:1,000 em 5 mL de mídia LB fresco e deixar as células crescem para a fase exponencial em 37 ° C em uma incubadora tremendo para 3-4 h. Medir o OD600 das células para confirmar que eles estão na fase exponencial (ou seja, , OD600 = 0,2 a 0,4). Nota: As imagens podem ser realizadas em qualquer fase de crescimento, dependendo do experimento que está sendo realizado.</li>
</ol>2. Preparação para slides
Nota: É importante usar a mídia que tem baixa autofluorescência. Qualquer meio que tenha baixa autofluorescência pode ser usado. Neste experimento, 1% agarose M63 almofadas de mídia mínimas e selagem com VaLaP19 é necessário para células de imagem em 3D.
<ol><li>
Prepare uma solução de 1% de agarose em 20 mL de mídia mínima.
	<ol>
<li>Microondas a solução até que a agarose é totalmente dissolvida ea solução parece clara.</li>
		<li>Mantenha a solução em um banho de água de 60 °C até que esteja pronto para usar. Nota: Esta solução pode ser solidificada e derretida conforme necessário ou pode ser alicitada em quantidades menores que são derretidas conforme necessário. Depois de vários usos, a mídia pode ficar descolorida e deve ser substituída.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Derreta o selante VaLaP em uma placa quente a 80 a 100 °C. Nota: Prepare valap, para ser usado como um selante, derretendo 50 g cada de vaselina, lanolina e parafina juntos em um copo em uma placa quente em 80-100 °C. Esta grande quantidade de VaLaP pode ser armazenada à temperatura ambiente indefinidamente e será suficiente para slides >500. O aquecimento a >100 °C fará com que se degrade e sua cor escurecerá.</li>
	<li>Coloque duas pilhas cada um dos três deslizamentos de cobertura de 20 mm x 20 mm nas extremidades opostas de um slide (seis coverslips total).</li>
	<li>Pipette 200 μL da solução da almofada do agarose na corrediça. Nota: Se não usar uma mancha fluorescente projetada, uma tintura da membrana pode ser adicionada à solução da almofada do agarose antes desta etapa. Resuspenda o corantes em água e adicione corantes a 1 mL da solução da almofada de agarose a uma concentração final de 5 μg/mL.</li>
	<li>Imediatamente e firmemente colocar um segundo slide para baixo na pilha de deslizamentos de cobertura para achatar o ágar e deixá-lo solidificar por 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Deslize cuidadosamente para fora do slide superior.</li>
	<li>Use a extremidade grande de uma ponta de pipeta de 200 μL para cortar almofadas individuais do gel (~5 milímetros no diâmetro) na corrediça e para rejeitar o gel malformado ou desnecessário. Nota: Se a imagem de imagens múltiplas cepas ou condições, uma almofada separada será necessária para cada um. Se apenas uma cepa deve ser imagem, fazer 3-4 almofadas para ajudar a suportar o coverslip.</li>
	<li>Células pipetas para cima e para baixo várias vezes para perturbar os grupos celulares e garantir que a cultura é bem misturada. Pipeta 1 μL de subcultura do passo 1.3 para um bloco. Nota: As reconstruções da forma da pilha exigem as pilhas individuais que não estão tocando em outras pilhas. Se o uso de culturas estacionárias de fase ou alta densidade celular, pode ser necessário diluir a amostra 1:10 antes de colocá-la na almofada.</li>
	<li>Deixe o ar da amostra secar por 5 a 10 min. Certifique-se de que a gota esteja completamente absorvida na almofada. Se algum líquido permanece, as pilhas mover-se-ão ao redor no líquido e não podem ser imaged.</li>
	<li>Coloque um deslizamento de cobertura na parte superior das almofadas.</li>
	<li>Selar o deslizamento de capa com VaLaP derretido por suavemente escovar em torno da borda do deslizamento de cobertura com um cotonete. Certifique-se de mantê-lo longe do topo do deslizamento de cobertura, onde o objetivo vai tocar. O VaLaP endurecerá em questão de segundos, selando a amostra.</li>
	<li>Imagem imediata da amostra. Nota: A amostra deve ser imagemda assim que o slide for preparado. As células podem crescer nas almofadas, e se eles dividem as reconstruções será mais difícil.</li>
</ol>3. Requisitos de imagem
<ol><li>Certifique-se de que o eixo z ou foco do microscópio pode fazer movimentos precisos de menos de 50 nm. Use z piezo estágios (ver Tabela de Materiais), disponível em microscópios de grau de pesquisa, porque os dispositivos de foco motorizado típico são incapazes de fornecer essa precisão. Nota: Supondo que o critério de amostragem Nyquist-Shannon20,é preciso ter a capacidade de mover 0,5 x o menor tamanho da etapa desejada, ou 2x a freqüência espacial desejada. Para as 100 etapas nm necessárias neste protocolo, uma etapa com uma precisão de 50 nm ou menos é necessária.</li>
	<li>
Certifique-se de que o microscópio contém um objetivo 100x com uma abertura numérica mínima (NA) de 1,45.
	<ol>
<li>Colete z-pilhas de entre 200-400 células diferentes para garantir que células suficientes sejam obtidas para aplicações a jusante. Nota: O número de células necessárias depende da variabilidade subjacente da amostra de interesse. Algumas das células recolhidas neste momento não vai fazê-lo através das etapas de reconstrução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Certifique-se de que a pilha z corresponda às configurações usadas para o canal de forma se um canal fluorescente secundário (proteína, rótulo metabólico, etc.) for medido.</li>
</ol>4. Imagem
<ol><li>Insira a lâmina selada no microscópio e deixe descansar por 5 min para equilibrar a temperatura com o ambiente, porque a sala de microscópio pode estar a uma temperatura diferente da sala de preparação da amostra.</li>
	<li>
Pegue uma pilha z fluorescente da amostra. NOTA: O z-pilha deve cobrir inteiramente a amostra com um z-espaçamento menos do que a profundidade de campo. Para um objetivo 1.45 NA 100x e ~1 μm de espessura células De E. coli, 40 passos a 100 nm por etapa funcionam bem. Para células maiores ou células que não se encontram perfeitamente planas na superfície, 50 ou mais passos podem ser necessários. Inclua etapas suficientes e certifique-se de que a amostra esteja totalmente borrada acima e abaixo.<ol>
<li>Use o software associado ao microscópio (ver Tabela de Materiais)para controlar o microscópio.</li>
		<li>Concentre-se no meio da célula usando as rodas de foco do microscópio. a aquisição nd verificar a caixa Z para tomar um z-pilha. Clique no botão Home para definir o meio da célula como ponto de partida. Defina o tamanho da etapa para 0,1 μm e definir o intervalo para 4 μm. Certifique-se de que o dispositivo Z está definido para o estágio piezo.</li>
		<li>Defina os canais fluorescentes a Janela Lambda para as configurações para as moléculas fluorescentes que estão sendo imagem. Neste experimento FORAM utilizados GFP e mCherry. Nota: Pegue um z-stack adicional com o mesmo tamanho de passo e alcance no segundo canal de cores, se a distribuição 3D de um canal fluorescente adicional é desejado. Neste experimento, mCherry citoplasmal foi usado para determinar a forma celular e MreB-GFP foi usado como um segundo canal de cor21.</li>
		<li>Certifique-se de que a Ordem do Experimento está definido como lambda (série z) para que ele vai ter um z-pilha completa em cada canal de cores antes de mudar.</li>
		<li>Clique no Run Now para iniciar a aquisição de imagem e salvar o arquivo onece one ou ambos z-pilhas estão completos.</li>
		<li>Mova-se para uma nova área na almofada e repita os passos 4.2.2-4.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Reconstrução celular
<ol><li>Culturas células individuais e salvar as imagens como um arquivo tiff empilhados para que haja apenas uma célula por arquivo. Certifique-se de que esta célula está bem isolada de quaisquer outras células (ou seja, cerca de 5x a largura total meio-máximo da função de desfoque em xy. NOTA: Isso pode ser feito usando software de análise de imagem disponível gratuitamente (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>Desenhe uma caixa em torno de uma célula individual e duplicar essa célula 2x, uma vez para cada canal. Certifique-se de que a caixa de hiperpilha duplicada é verificada e altere o canal para 1 ou 2, certificando-se de que as fatias incluem toda a pilha z. Nota: Se a imagem apenas a forma das células e não uma proteína fluorescente adicional, apenas um canal estará presente.</li>
		<li>Uma vez que ambas as pilhas estão disponíveis vá para Imagens | Pilhas | Ferramentas | Concatenate para combinar as imagens com o canal de proteína primeiro e o canal de forma em segundo lugar.</li>
		<li>Salve a nova imagem como um arquivo de tiff.</li>
	</ol></li>
	<li>Medir a função de desfoque do microscópio usando subdiffraction limitada contas fluorescentes22. Isso precisa ser feito para cada objetivo de microscópio e microscópio, mas pode ser realizado antes ou depois de imagem as amostras de interesse.
	<ol>
<li>Média junto vários grânulos independentes com alguma intervenção manual usando o software disponível (veja a tabela dos materiais). Nota: O produto final deve ser uma imagem 3D da função de desfoque com o mesmo espaçamento xyz como as amostras de interesse.</li>
	</ol></li>
	<li>Executar os scripts de reconstrução de forma de célula de convolução para a frente usando o software disponível. A versão mais recente desses scripts pode ser baixada gratuitamente de https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
	<ol>
<li>Faça uma pasta dentro de uma pasta na área de trabalho que contém as imagens cortadas e o arquivo cell_shape_settings_tri.txt de shae-cellshape-public/exampleData_tri.</li>
		<li>Edite cell_shape_setting_tri.txt para ter as configurações corretas para o experimento de interesse. Para este experimento, o arquivo de configurações inclui as seguintes linhas: nm_per_pixel 70 nm_per_pixel 70 Z_scale 0,65 Z_scale 0,65 stack_z_size 41 stack_z_size 41 stack_t_size 1 stack_t_size 1 Fstack_z_size 41 Fstack_z_size 41 Fstack_t_size 1 Fstack_t_size 1 stack_seperation_nm 100 stack_seperation_nm 100 Fstack_seperation_nm 100 Fstack_seperation_nm 100 psfScript -999 osuPSF20180726 psfScript -999 osuPSF20180726 gradiente 1 Nota: Este arquivo de texto é organizado em seções e cada seção é analisada em sua própria variável. Enquanto muitas das configurações não precisam ser alteradas de experimento para experimento, deve-se certificar de que o tamanho da pilha z(stack_z_size para a forma, Fstack_z_size para proteína de interesse), espaçamento do z-stack(stack_seperation_ nm, Fstack_seperation_nm), mudança focal relativa do microscópio(Z_scale)23, o tamanho do pixel em xy (nm_per_pixel),e o nome do script que carrega a função de desfoque do microscópio (psfScript ) corresponda ao experimento. O campo de gradiente deve ser definido para 1 se o canal de forma é citomicamente preenchido e 0 se for um objeto manchado de membrana.</li>
		<li>Executar Cell_shape_detector3dConvTriFolder função (shae-cellshape-público/CellShapeDetectorTri/) com a corda para a localização da pasta seguido pelo número da célula para iniciar, e o número de células que você deseja executar. Nota: Um exemplo para a entrada será o seguinte: Cell_shape_detector3dConvTriFpast ('caminho para pasta com imagens cortadas', índice inicial na pasta, # de células). Uma célula típica pode levar entre 5 a 20 min para que a reconstrução converga e termine.</li>
	</ol></li>
	<li>Selecione as reconstruções celulares para garantir que elas estejam corretas antes de usar as células para qualquer análise estatística.
	<ol>
<li>Executar ScreenFits (shae-cellshape-público/ shae-fitViewerGui/) para selecionar visualmente reconstruções celulares individuais.</li>
		<li>Clique no botão de pasta selecionada quando a interface gráfica do usuário (GUI) abrir e, em seguida, selecione a pasta com os arquivos de dados de reconstrução (TRI.mat) criados na etapa 5.3.</li>
		<li>Selecione a caixa ao lado da reconstrução celular se uma célula aparecer disforme ou não convergir totalmente(Figura 3). Isso pode parecer uma cela com um buraco, um lado plano, ou um galho saindo dela. Isso irá anexar'FLAG' para o nome do arquivo para que ele possa ser excluído de qualquer análise a jusante. Nota: A célula reconstruída pode ser comparada às imagens originais. Isto pode ser especial importante se suas pilhas vêm de uma população heterogenous várias das formas.</li>
	</ol></li>
	<li>Executar enriquecimentoSmoothingSpline (shae-cellshape-público/) para criar um perfil de enriquecimento da concentração relativa da proteína de interesse em função da curvatura gaussiana na superfície.
	<ol>
<li>Selecione cada pasta com arquivos TRI.mat criados na etapa 5.3.3.</li>
		<li>Selecione o recém-criado (5,5,1) arquivo curve.mat. Nota: Um arquivo curve.mat será criado para cada pasta que foi selecionada em 5,5,1. Todos os perfis de enriquecimento serão apresentados em um gráfico. Se os gráficos individuais são necessários do que o funcionamento 5.5 para cada pasta. Nota: Além da localização geométrica precisa de uma proteína fluorescente, existem muitas outras maneiras de analisar os dados do canal secundário, incluindo a contagem do número, tamanho e orientação dos objetos4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a divulgar.

Um passo crítico neste protocolo é a aquisição de imagens de alta qualidade. Para reconstruir adequadamente as células, deve haver desfoque suficiente acima e abaixo da célula. Portanto, é imperativo que o z-pilha tomadas cobre uma distância grande o suficiente. O número de etapas tomadas durante a aquisição de imagem pode ser ajustado para cada cepa. Por exemplo, as células De E. coli excluídas para rodZ são mais largas e exigem mais passos e, portanto, uma distância maior do que as células do tipo selvagem. Se a amostra deriva durante a aquisição de imagem, a reconstrução pode ter grandes erros. Portanto, é importante deixar o slide chegar ao equilíbrio térmico com o microscópio antes de imagem para evitar a deriva durante a aquisição z-stack. As células devem ser imagemdas em almofadas com baixa autofluorescência. Componentes de mídia, como os encontrados no meio LB comum, têm autofluorescência que pode causar problemas ao tentar reconstruir as células. A densidade das células na almofada de imagem é importante porque o processo de reconstrução é realizado de forma independente em cada célula. Muito poucas células aumentarão o tempo necessário para obter imagens de um número suficiente de células, enquanto muitas células resultarão em campos de imagem que são muito densos para facilmente cortar células individuais. Como nem todas as células reconstroem corretamente, as células extras devem ser imagemdas durante a etapa de aquisição e todas as saídas devem ser rastreadas antes de avançar com análise estatística(Figura 3).
Muitas das limitações para este método são técnicas. No microscópio a ser usado, deve-se ter um objetivo que tenha uma abertura numérica alta (tipicamente >1.4), porque isso permite a secção óptica na escala de tamanho das bactérias. Além disso, o microscópio precisa ser equipado com um estágio piezo que pode dar pequenos passos precisos na direção z. Além disso, embora não seja necessário, o acesso a recursos computacionais de alta taxa de taxa de alta taxa de vida para executar o software de análise de imagem é altamente recomendado porque reduzirá o tempo de processamento para reconstruir as células.
Uma limitação conceitual ao método é que as escalas de energia corretas para ponderar a suavidade da reconstrução em relação à relação sinal/ruído das imagens devem ser escolhidas. Para validar uma escolha de parâmetros, os tamanhos e formas das células devem ser medidos usando métodos independentes, como microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ou microscopia de força atômica (AFM). Como prova de princípio, as reconstruções 3D das células foram realizadas em um AFM para testar a precisão z (<50 nm) ou em uma grade TEM para testar a precisão da xixidade (<30 nm)3. Tal abordagem correlacionada é demorada e cara. Uma aproximação mais simples pode ser às amostras padrão da imagem tais como pilhas selvagens do tipo ou 1 grânulos esféricos do μm. O diâmetro e a esfericidade das reconstruções podem ser usados para garantir que as escalas de tamanho e energia utilizadas na reconstrução estejam corretas.
Este não é o único método que busca extrair informações espaciais de alta resolução a partir de imagens de microscopia de fluorescência. Muitos artigos de revisão descrevem os avanços recentes no campo da microscopia super-resolução24,25. Técnicas de resolução de reforço, como a microscopia de conconvolução26,a microscopia confocal de disco giratório27,a redesignação de pixels28e a microscopia de iluminação estruturada (SIM)29 procuram melhorar a resolução do imagens adquiridas pelo microscópio. Esses métodos não são incompatíveis com a abordagem apresentada. Recentemente, este método foi adaptado para permitir imagens baseadas em SIM como entradas9. Enquanto o método de convolução para a frente compartilha alguns de seus fundamentos com microscopia de deconvolução, ele tem uma saída completamente diferente. Enquanto abordagens como a microscopia de deconvolução procuram melhorar a resolução da imagem, essa abordagem não gera uma imagem, mas sim uma reconstrução da forma celular com aproximadamente 50 nm de precisão. Técnicas de microscopia de controle ativo de molécula única baseadas em amostras esparsamente rotuladas podem fornecer níveis ainda mais altos de precisão espacial do que este método. Em muitos casos, essas abordagens de moléculaúnica saem que necessitam de otimização das construções fluorescentes e podem exigir longos tempos de aquisição, tornando-os difíceis de usar com amostras vivas ou dinâmicas. Cada um desses métodos vem com uma ou mais ressalvas de que este método não. Por exemplo, os benefícios anunciados pela microscopia confocal de disco giratório não são tão aplicáveis a monocamadas de células bacterianas, onde não há muito fora da luz do avião. Além disso, este método fornece um encanamento para adquirir formas exatas da pilha 3D e a localização da proteína sem a necessidade de nenhuns fluorophores especializados. Este método tem requisitos mínimos de hardware (ou seja, z piezo, alto objetivo NA) e requer apenas dezenas de imagens por ponto de tempo, permitindo que se investiguem facilmente estruturas 3D dinâmicas6.
Tem havido um número crescente de abordagens para estudar a organização de células bacterianas em estruturas 3D. Estes incluem abordagens conceitualmente semelhantes a esta que se aproveitam de alta qualidade, imagens de fluorescência 3D30,31,32. Esta abordagem requer células bem isoladas e não faz suposições a priori sobre geometria celular. No entanto, para se mover em agregados celulares densos ou biofilmes, as células são assumidas como haste-like. Esta visão de resolução inferior ainda permite investigar arranjos de embalagem das células, embora a alta densidade de células no biofilme impeça a análise da localização subcelular de fatores específicos.
No futuro, pode ser interessante desenvolver uma estrutura para integrar a molécula única e abordagens de campo amplo com esta técnica de reconstrução 3D. Além disso, pode ser possível incluir essa abordagem de convolução avançada com ferramentas de segmentação de visão automática32 para permitir reconstruções de aglomerados celulares mais densos.
Por que as células evoluíram para formas específicas é uma questão complexa que deve refletir o ambiente complexo em que vivem. Compreender a evolução e a função das formas celulares requer tomar medidas precisas e precisas dessas formas, que é o que este método fornece.

Células de todos os tipos regulam suas formas para funções específicas. Por exemplo, os neurônios são moldados de forma diferente das células sanguíneas e têm funções diferentes. Da mesma forma, as células bacterianas vêm em uma variedade de formas e tamanhos, embora o propósito dessas formas nem sempre seja conhecido1,2. Portanto, é importante que a forma das células bacterianas seja determinada com precisão. O método delineado mostra uma maneira facilmente implementada de coletar dados adequados para a análise 3D da maioria das células bacterianas vivas ou fixas.
O método descrito permite que se tome imagens 3D de células bacterianas, a fim de representar com precisão a forma de célula 3D da amostra e para localizar com precisão as proteínas dentro destas formas. Técnicas tradicionais de microscopia tiram imagens 2D, o que é problemático ao estudar células que têm formas anormais ou não simétricas, como mutantes de Escherichia coli,ou bactérias curvas como vibrio cholerae e Helicobacter pylori. Embora as imagens 3D de alta resolução sejam a principal entrada para este método, o método não retorna uma imagem melhorada pela resolução. Em vez disso, este método reconstrói as coordenadas de superfície 3D e a forma da célula usando um algoritmo de convolução para a frente usando contornos ativos e a aparente função de desfoque do microscópio3 (Figura 1). Ele tem sido usado para estudar o ato bacteriano homolog MreB em E. coli4,5,6,7, o novo elemento periskeletal CrvA em V. cholerae8, e o putativo bactofilin ccma em Helicobacter pylori9 (Figura 2).
A localização das proteínas pode dar uma visão sobre suas funções. Por exemplo, as proteínas envolvidas na divisão celular são normalmente localizadas para a célula média10,11. Estudos de alta vesperção foram realizados para localizar todas as proteínas de uma bactéria na esperança de obter informações sobre suas funções12. Infelizmente, esses estudos foram realizados com imagens 2D e análise 1D ou 2D, impossibilitando a mensuração de aspectos específicos da localização de proteínas, como localização de características geométricas celulares.
Por exemplo, mreb, uma proteína dinâmica necessária para a forma da haste de muitas bactérias, é hipotetizado para trabalhar, direcionando a localização da síntese da parede celular, e sua localização espelha a localização da síntese da parede celular7,13. MreB de várias espécies mostra enriquecimento geométrico4,6,7,14,15. Polímeros de superfície dinâmicos, como mreb, pode acoplar a geometria da superfície para o tempo médio de enriquecimento perfil16 e pode ser capaz de orientar a geometrias específicas, minimizando a energia associada com a ligação à membrana17. Embora a importância de torcer, agrupar, dobrar e dinâmica não tenha sido totalmente resolvida para a MreB, é importante notar que medições precisas de ambas as curvas principais de uma superfície exigem uma representação 3D completa da célula. Portanto, para medir com mais precisão as curvaturas às quais as proteínas se localizam, é preferencial usar imagens 3D, em vez de imagens 2D. A imagem 3D elimina a necessidade de estimar computacionalmente as curvaturas que não podem ser medidas em 2D, uma estimativa que pode não ser precisa em células assimétricas18.
Embora a imagem latente 2D das pilhas seja mais rápida e não exija tanto trabalho computacional da pós-imagem, a imagem latente 3D fornece uma respresentação mais exata da pilha, assim como a habilidade de medir características de superfície, tais como a curvatura, que não pode ser medida em 2D. Portanto, à medida que a imagem 3D se torna mais comum, novos insights sobre a forma celular e a localização de proteínas se tornarão possíveis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50nm fluorescent beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td>these are used to measure the blurring function of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>Puritan Medical Products Company LLC</td>
			<td>S304659</td>
			<td>used to appy VaLaP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>used to cro cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LST3166</td>
			<td>membrane dye used to stain cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>Huygens essential or professional</td>
			<td>Use to measure blurring function of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7387</td>
			<td>combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB growth medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 medium</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>M1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Needed to run forward convolution scripts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nkon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Equate</td>
			<td>49035-038-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezo z stage</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77011589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet tips -p200</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet tips- p10</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization

A forma de uma bactéria é importante para sua fisiologia. Muitos aspectos da fisiologia celular, como motilidade celular, predação e produção de biofilme, podem ser afetados pela forma celular. As células bacterianas são objetos tridimensionais (3D), embora raramente sejam tratadas como tal. A maioria das técnicas de microscopia resulta em imagens bidimensionais (2D) levando à perda de dados relativos à forma real de células 3D e localização de proteínas. Certos parâmetros de forma, como a curvatura gaussiana (produto das duas principais curvaturas), só podem ser medidos em 3D porque as imagens 2D não medem ambas as curvaturas principais. Além disso, nem todas as células ficam planas ao montar e imagens 2D de células curvas podem não representar com precisão as formas dessas células. Medir com precisão a localização de proteínas em 3D pode ajudar a determinar a regulação espacial e a função das proteínas. Uma técnica de convolução para a frente foi desenvolvida que usa a função de desfoque do microscópio para reconstruir formas de células 3D e localizar com precisão proteínas. Aqui, um protocolo para preparar e montar amostras para imagens de células vivas de bactérias em 3D tanto para reconstruir uma forma celular precisa quanto para localizar proteínas é descrito. O método é baseado na preparação simples da amostra, na aquisição fluorescente da imagem, e no processamento matlab-baseado da imagem. Muitos microscópios fluorescentes de alta qualidade podem ser simplesmente modificados para tomar essas medições. Essas reconstruções celulares são computacionalmente intensivas e o acesso a recursos computacionais de alta qualidade é recomendado, embora não seja necessário. Este método foi aplicado com sucesso a várias espécies bacterianas e mutantes, modalidades de imagem fluorescente e fabricantes de microscópio.

As bactérias vêm em uma grande variedade de formas e tamanhos que podem determinar suas funções na natureza1. O resultado deste procedimento é uma representação 3D precisa das células da convolução para a frente de uma z-pilha de imagens (Figura 1). Este método é especialmente importante quando se lida com células curvas (Figura 2), ou com células anormalmente moldadas (Figura 4A), como uma representação 2D não reflete a curvatura das células com precisão. Para usar o método de convolução para a frente (Figura 1A),as células precisam ser perifericamente manchadas ou ter uma mancha citoplasmática (Figura 2B esquerda vs direita).
A figura 4 mostra a localização do MreB na célula. Uma fusão GFP foi feita para a proteína de actina bacteriana MreB21, a fim de estudar a sua localização precisa em ambos os tipos selvagens e células e. coli mutantes4. Como o MreB está associado à membrana, a imagem 3D é necessária para reproduzir fielmente sua posição na célula. Ao fazer essas medições em 3D, fomos capazes de reconstruir as formas de ambos os tipos selvagens e células mutantes rodZ (Figura 4A). A localização do MREB mostrou-se enriquecida em pequenas curvaturas gaussianas, uma característica geométrica que só pode ser medida em 3D, de forma dependente de RodZ (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig1.jpg"> Figura 1: O método de convolução para a frente reconstrói as células sem conhecimento prévio da forma celular. (A) A saída final do método é uma reconstrução de células 3D derivada comparando uma forma de teste com a função de desfoque calibrada do microscópio. Isso é comparado com o z-stack observado até que a imagem 3D observada corresponda à hipotética. A imagem mostrada aqui é uma rendição da reconstrução de uma célula c. crescentus. (B) O gasoduto de reconstrução atualiza iterativamente as posições estimadas dos elementos de superfície com base na pilha de imagem observada. Para detalhes algorítmicos completos do método, consulte Nguyen3. (C)O pipeline de reconstrução começa sem um conhecimento priori da forma da célula e atualiza a posição e o número de vérteges de superfície para coincidir com o z-stack observado. Imagens representativas de cada 30 passos durante a reconstrução 3D são mostradas a partir de três ângulos diferentes de uma célula V. cholerae. As posições superficiais desta forma são atualizadas para minimizar a diferença entre as pilhas simuladas e observadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig2.jpg"> Figura 2: Reconstruções representativas 3D de três espécies bacterianas em forma diferente. Reconstruções tridimensionais podem ser feitas a partir de células com sua membrana manchada (esquerda) ou preenchidas com um fluoroffora citoplasmacomico (direita). A forma e a curvatura da célula inicial não são importantes, pois uma haste dobrada, haste torcida ou haste reta são capazes de ser reconstruídas com precisão. As superfícies reconstruídas são coloridas com base na curvatura gaussiana local da superfície. Barra de escala = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig3a.jpg"> Figura 3: As reconstruções podem falhar por várias razões. As células devem ser rastreadas para garantir que o algoritmo de reconstrução convergiu para um resultado razoável. Esquerda = tipo selvagem representativo (superior) e rodZ mutante (inferior) células E. coli que passaram o controle de qualidade. Direita = células que não conseguiram reconstruir corretamente e não passaram pelo controle de qualidade. Cinco classes de convergência fracassada são mostradas: (i) células que estão muito perto da borda da região de cultivo levando a uma demarcação acentuada, (ii) células que estão muito perto de outra célula, (iii) células que produziram um divot, (iv) células que não prossigam além do s inicial Tarting ponto, e (v) outros erros desconhecidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig4.jpg"> Figura 4: Dados representativos que mostram a localização da proteína às geometrias celulares específicas. (A) Células reconstruídas tridimensionais de tipo selvagem e células rodZ E. coli com curvatura gaussiana e intensidade de fluorescência do MreB exibidas. Barra de escala = 1 μm. (B) Lotes de enriquecimento de MreB de tipo selvagem e células rodZ E. coli. Valores >1 mostram enriquecimento e valores <1 mostram esgotamento de MreB dessas regiões celulares em relação à cobertura uniforme da célula. Áreas sombreadas indicam intervalo de confiança de 90% da média. A curva para cada cepa é uma spline de alisamento cúbico e é truncada usando um limite de probabilidade para curvasturas extremas de p > 5 x 10-3. Esta figura foi modificada de (Bratton et al.) 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

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Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

Este protocolo explica como preparar e montar amostras bacterianas para imagens tridimensionais vivas e como reconstruir a forma tridimensional de E. coli a partir dessas imagens.

Imagem tridimensional de células bacterianas para representações celulares precisas e localização precisa de proteínas

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Como as bactérias são tão pequenas, as pessoas muitas vezes esquecem que são objetos tridimensionais. Nosso protocolo permite a reconstrução precisa das formas de células planas e curvas. Este protocolo requer apenas pequenas modificações em um microscópio padrão e eles estão prontamente disponíveis em scripts MATLAB.Antes de começar, o experimento coloca duas pilhas de cada uma das três coberturas de 20 por 20 milímetros nas extremidades opostas de um único slide de microscópio de vidro. Pipeta 200 microliters de solução de almofada agarose sobre o slide e imediatamente e firmemente colocar um segundo slide sobre a pilha de deslizamentos de cobertura para achatar a agarose. Depois de permitir que a agarose se solidifique por cerca de um minuto à temperatura ambiente, deslize cuidadosamente para fora do slide superior e use uma grande extremidade de uma ponta de pipeta de 200 microliter para cortar almofadas individuais de cinco milímetros de diâmetro do gel.Quando todas as almofadas foram obtidas pipeta a cultura celular E.coli várias vezes para interromper qualquer aglomerado celular e para garantir que as células sejam distribuídas de forma homogênea antes de adicionar um microliter de subcultura em cada almofada. Depois de deixar as amostras secarem o ar por cinco a 10 minutos, confirme que as gotículas foram completamente absorvidas nas almofadas antes de colocar uma tampa nas almofadas. Em seguida, use um cotonete para escovar suavemente um selante apropriado ao redor da borda do deslizamento da tampa, tomando o cuidado de manter o selante longe da parte superior do deslizamento da tampa.Imediatamente após a vedação do deslizamento de cobertura coloque o slide em um estágio de microscópio e após cinco minutos de equilíbrio térmico use as rodas de foco do microscópio para colocar o meio de uma célula em foco. No software de microscópio associado sob ND Acquisition, verifique a caixa Z para adquirir uma pilha Z e clique no botão Home para definir o meio da célula como o ponto de partida. Defina o tamanho do passo para 0,1 micrômetros e o intervalo para quatro micrômetros e certifique-se de que o Dispositivo Z esteja definido para o estágio Piezo.É fundamental que haja uma desfoca suficiente na parte superior e inferior da célula para que a célula seja quase indistinguível do fundo. Defina os canais fluorescentes sob a janela lambda para as configurações das moléculas fluorescentes que estão sendo imagens e confirme que a ordem do experimento é definida como lambda para que uma pilha Z completa seja obtida em cada canal de cores antes de mudar. Em seguida, clique em Executar agora para começar a aquisição da imagem.Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas abram os arquivos em um programa de software de análise de imagem apropriado. Desenhe uma caixa em torno de uma célula individual e duplique essa célula duas vezes, uma vez para cada canal, certificando-se de que a caixa de hiperseco duplicada seja verificada e mude o canal para uma ou duas. Uma vez que ambas as pilhas estejam disponíveis, selecione Imagens, Pilhas, Ferramentas e Concatenato para combinar as imagens.Com o canal de proteína em primeiro lugar e o canal de forma em segundo lugar. Depois de salvar a nova imagem como um arquivo TIFF faça uma pasta dentro de uma pasta na área de trabalho que contém as imagens cortadas e o cell_shape_settings_tri. arquivo txt de shae-cellshape-public exampleData_tri.Editar o cell_shape_settings_tri. arquivo txt para ter as configurações corretas para o experimento de interesse. E execute a função Cell_shape_detector3dConvTriFolder com a sequência até o local da pasta, seguida pelo número da célula em que iniciar e o número de células que devem ser executadas.Para confirmar se as células foram devidamente reconstruídas, execute o ScreenFits. Quando a interface gráfica do usuário for aberta, clique no botão Selecionar pasta e selecione a pasta com os arquivos de dados de reconstrução para analisar visualmente as reconstruções celulares individuais. Para qualquer célula que pareça disforme ou que não tenha cobertura completa, selecione a caixa ao lado da reconstrução para anexar FLAG ao nome para que possa ser excluída de qualquer análise a jusante.Executar enriquecimentoSmothingSpline para criar um perfil de enriquecimento da concentração relativa da proteína de interesse em função da curvatura gaussiana na superfície. Em seguida, selecione cada pasta com o TRI criado. arquivos de tapete e selecione o arquivo de tapete de curva recém-criado.Este método é especialmente útil ao lidar com células curvas ou de forma anormal como uma representação 2D não pode refletir a curvatura das células com precisão. Neste experimento, uma proteína de fusão fluorescente verde à proteína de actina bacteriana MreB foi gerada para estudar a localização precisa da proteína actina tanto no tipo selvagem quanto nas células mutantes de E.coli. Ao fazer essas medições em imagens capturadas em 3D, as formas tanto do tipo selvagem quanto das células mutantes rodZ foram capazes de serem reconstruídas.A localização do MreB foi então determinada a ser enriquecida em pequenas curvaturas gaussianas, uma característica geométrica que só pode ser medida em 3D de forma dependente de rodZ. Lembre-se de ter certeza de que a pilha Z é grande o suficiente para que as células estejam borradas na parte superior e inferior e que as células estejam bem espaçadas umas das outras. Estamos mostrando como medir a localização geométrica de proteínas em 3D, mas outras informações podem ser calculadas a partir desses dados, como o tamanho dos conjuntos de proteínas de etiqueta.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens Folha Inteira

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

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Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

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A saliva, glândula salivar, e Coleta de hemolinfa de carrapatos Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

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This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

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Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

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