Name: three-dimensional imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization
Uploaded: 2019-10-29T14:30:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Джеффри Нгуена и Джошуа Шаевица за помощь в разработке этого метода. Финансирование: RMM - NIH F32 GM103290-01A1, BPB - Гленн Центры исследований старения и Национальный научный фонд PHY-1734030.

<ol>
	<li>Young, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Selective+Value+of+Bacterial+Shape.">The Selective Value of Bacterial Shape.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).</li><li>Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Curved+Shape+of+Caulobacter+crescentus+Enhances+Surface+Colonization+in+Flow.">The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow.</a> Nature Communications. 5, 3824 (2014).</li><li>Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Hong, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. , 227-245 (2016).</li><li>Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB+Polymers+and+Curvature+Localization+are+Enhanced+by+RodZ+and+Predict+E.+coli's+Cylindrical+Uniformity.">MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity.</a> Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).</li><li>Ouzounov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB+Orientation+Correlates+with+Cell+Diameter+in+Escherichia+coli.">MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).</li><li>Morgenstein, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RodZ+links+MreB+to+Cell+Wall+Synthesis+to+Mediate+MreB+rotation+and+Robust+Morphogenesis.">RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).</li><li>Ursell, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-Like+Bacterial+Shape+is+Maintained+by+Feedback+Between+Cell+Curvature+and+Cytoskeletal+Localization.">Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization.</a> Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).</li><li>Bartlett, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Periplasmic+Polymer+Curves+Vibrio+cholerae+and+Promotes+Pathogenesis.">A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis.</a> Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).</li><li>Taylor, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Cytoskeletal+Proteins+Define+Zones+of+Enhanced+Cell+Wall+Synthesis+in+Helicobacter+pylori.">Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori.</a> bioRxiv. , 545517 (2019).</li><li>Egan, A. J. F., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physiology+of+Bacterial+Cell+Division.">The Physiology of Bacterial Cell Division.</a> Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division:+Assembly,+Maintenance+and+Disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).</li><li>Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+of+Bacterial+Protein+Localization.">High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization.</a> Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).</li><li>de Pedro, M. A., Quintela, J. C., H&#246;ltje, J. V., Schwarz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murein+Segregation+in+Escherichia+coli.">Murein Segregation in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).</li><li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MreB+Filaments+Align+Along+Greatest+Principal+Membrane+Curvature+to+Orient+Cell+Wall+Synthesis.">MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis.</a> eLife. 7, e32471 (2018).</li><li>Wong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Strain+Sensing+Implicated+in+Cell+Shape+Recovery+in+Escherichia+coli.">Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli.</a> Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).</li><li>Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+and+Dynamics+of+Translocating+MreB+Filaments+on+Curved+Membranes.">Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes.</a> eLife. 8, e40472 (2019).</li><li>Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+Selection+of+Surface-Bound+Helical+Filaments:+Biopolymers+on+Curved+Membranes.">Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes.</a> Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).</li><li>Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RodZ+Modulates+Geometric+Localization+of+the+Bacterial+Actin+MreB+to+Regulate+Cell+Shape.">RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape.</a> Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).</li><li>Shannon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+Presence+of+Noise.">Communication in the Presence of Noise.</a> Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).</li><li>Billings, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+Morphogenesis+in+L-Forms+Via+Geometric+Control+of+Cell+Growth.">De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth.</a> Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).</li><li>. Measuring a Point Spread Function Available from: <a target="_blank" href="https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function">https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function</a> (2012)</li><li>Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Experimental+Methods+for+Determining+the+Apparent+Focal+Shift+in+a+Microscope+System.">Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System.</a> PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).</li><li>Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Spectroscopy+and+Imaging+over+the+decades.">Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades.</a> Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+in+Cell+Biology.">Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).</li><li>Sarder, P., Nehorai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+Methods+for+3-D+Fluorescence+Microscopy+Images.">Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images.</a> IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M., Waters, J. C., Wittman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12, 1205 (2015).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+Lateral+Resolution+Limit+by+a+Factor+of+Two+Using+Structured+Illumination+Microscopy.">Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Molecule+Labeling+of+Live+Cell+Surfaces+for+Three-Dimensional+Super-Resolution+Microscopy.">Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).</li><li>Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+cholerae+Biofilm+Growth+Program+and+Architecture+Revealed+by+Single-Cell+Live+Imaging.">Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bact-3D:+A+level+set+segmentation+approach+for+dense+multi-layered+3D+bacterial+biofilms.">Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms.</a> 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Важным шагом в этом протоколе является приобретение высококачественных изображений. Чтобы правильно реконструировать клетки, должно быть достаточно размытия выше и ниже клетки. Поэтому крайне важно, чтобы принятый z-стек преодолел достаточно большое расстояние. Количество шагов, сделанных при приобретении изображения, может быть скорректировано для каждого штамма. Например, клетки кишечной палочки, удаленные для стержня, шире и требуют большего количества шагов, а значит, и большего расстояния, чем клетки дикого типа. Если образец дрейфует во время приобретения изображения, реконструкция может иметь серьезные ошибки. Поэтому важно, чтобы слайд прийти к тепловому равновесию с микроскопом перед визуализацией, чтобы избежать дрейфа во время приобретения z-стек. Клетки должны быть изображены на колодках с низкой аутофлуоресценцией. Компоненты мультимедиа, например, в общей среде LB, имеют автофлюоресценцию, которая может вызвать проблемы при попытке реконструировать клетки. Плотность клеток на панели изображений важна, потому что процесс реконструкции выполняется независимо на каждой клетке. Слишком мало клеток увеличит время, необходимое для получения изображений достаточного количества клеток, в то время как слишком много клеток приведет к визуализации полей, которые слишком плотны, чтобы легко обрезать отдельные клетки. Поскольку не все ячейки реконструируются должным образом, дополнительные ячейки должны быть изображены во время этапа приобретения, и все выходы должны быть проверены, прежде чем двигаться вперед со статистическим анализом (Рисунок 3).
Многие ограничения для этого метода носят технический характер. На микроскоп, который будет использоваться, необходимо иметь цель, которая имеет высокую численную диафрагму (как правило, 1,4), потому что это позволяет оптического сечения на размер масштаба бактерий. Кроме того, микроскоп должен быть оснащен пьезо этап, который может принимать небольшие, точные шаги в z-направление. Кроме того, хотя это и не является необходимым, доступ к высокопроизводительным вычислительным ресурсам для запуска программного обеспечения для анализа изображений настоятельно рекомендуется, поскольку это сократит время обработки для восстановления ячеек.
Одним из концептуальных ограничений метода является то, что должны быть выбраны правильные энергетические весы для взвешивания плавности хода реконструкции относительно соотношения сигнала к шуму изображений. Для проверки выбора параметров размеры и формы клеток должны быть измерены с помощью независимых методов, таких как электронная микроскопия передачи (TEM) или атомная силовая микроскопия (AFM). В качестве доказательства принципа, 3D-реконструкции клеток были выполнены либо на AFM для проверки на z-точность (Злт;50 нм) или на сетке TEM для проверки на точность xy (Злт;30 нм)3. Такой коррелированный подход занимает много времени и обходится дорого. Более простой подход может быть к изображению стандартных образцов, таких как дикие клетки типа или 1 мкм сферические бусы. Диаметр и сферичность реконструкций могут быть использованы для обеспечения правильности размеров и энергетических масштабов, используемых в реконструкции.
Это не единственный метод, который стремится извлечь пространственную информацию высокого разрешения из флуоресцентных микроскопических изображений. Многие обзорные статьи описывают последние достижения в области супер-разрешения микроскопии24,25. Разрешение повышения методов, таких как деконволуционная микроскопия26, спиннинг диска конфокальная микроскопия27, пиксель переназначения28, и структурированная микроскопия освещения (SIM)29 стремятся улучшить разрешение изображения, полученные микроскопом. Эти методы не несовместимы с представленным подходом. Недавно этот метод был адаптирован для SIM-изображений в качестве входов9. В то время как метод переднего свертывания разделяет некоторые из его основ с микроскопией деконволуционного, он имеет совершенно другой выход. В то время как такие подходы, как микроскопия деконволюции, направлены на улучшение разрешения изображения, этот подход не генерирует изображение, а скорее реконструкцию формы клетки с точностью примерно 50 нм. Одномолекулярные методы активного контроля микроскопии, основанные на редко маркированных образцах, могут обеспечить еще более высокий уровень пространственной точности, чем этот метод. Во многих случаях эти подходы к одной молекуле требуют оптимизации флуоресцентных конструкций и могут потребовать длительного времени приобретения, что затрудняет их использование с живыми или динамическими образцами. Каждый из этих методов поставляется с одним или несколько предостережениями, что этот метод не делает. Например, преимущества, рекламируемые спиннинг диска конфокальной микроскопии не так применимы к монослойбактерии бактериальных клеток, где есть не так много из плоскости света. Кроме того, этот метод обеспечивает конвейер для получения точных форм 3D-клеток и локализации белка без необходимости каких-либо специализированных фторофоров. Этот метод имеет минимальные аппаратные требования (т.е. z piezo, высокая цель NA) и требует только десятков изображений на временную точку, что позволяет легко исследовать динамические 3D структуры6.
Растет число подходов к изучению организации бактериальных клеток в 3D-структурах. К ним относятся подходы концептуально похожи ею, которые пользуются высоким качеством, 3D флуоресценции изображения30,31,32. Такой подход требует хорошо изолированных клеток и не делает априорных предположений о клеточной геометрии. Однако, чтобы перейти в плотные клеточные агрегаты или биопленки, клетки, как предполагается, стержня, как. Такое низкое разрешение по-прежнему позволяет исследовать расположения упаковки клеток, хотя высокая плотность клеток в биопленке предотвращает анализ субклеточной локализации конкретных факторов.
В будущем может быть интересно разработать рамки для интеграции единой молекулы и широкоугольных подходов с этой 3D-техникой реконструкции. Кроме того, можно включить этот подход к передним свертывания с инструментами сегментации машинного зрения32, позволяющие проводить реконструкции более плотных клеточных кластеров.
Почему клетки превратились в конкретные формы является сложным вопросом, который должен отражать сложную среду, в которой они живут. Понимание эволюции и функции клеточных форм требует точного и точного измерения этих форм, что и дает этот метод.

Клетки всех типов регулируют их формы для специфических функций. Например, нейроны имеют форму иначе, чем клетки крови и имеют различные функции. Аналогичным образом, бактериальные клетки бывают различных форм и размеров, хотя цель этих форм не всегда известно1,2. Поэтому важно точно определить форму бактериальных клеток. Описанный метод показывает легко реализованный способ сбора данных, подходящих для 3D-анализа большинства живых или фиксированных бактериальных клеток.
Описанный метод позволяет принимать 3D-изображения бактериальных клеток для того, чтобы точно представлять форму 3D-клеток образца и точно локализовать белки в этих формах. Традиционные методы микроскопии принимают 2D изображения, что проблематично при изучении клеток, которые имеют ненормальные или несимметричные формы, такие как мутанты кишечной палочки, или изогнутые бактерии, такие как Vibrio cholerae и Helicobacter пилори. В то время как 3D-изображения с высоким разрешением являются ключевым входном элементом этого метода, метод не возвращает изображение с разрешением. Скорее, этот метод реконструирует 3D-координаты поверхности и форму ячейки с помощью алгоритма переднего свертывания с использованием активных контуров и очевидной функции размытия микроскопа3 (Рисунок 1). Он был использован для изучения бактериального актина омолог MreB в E. coli4,5,6,7, роман перискелетный элемент CrvA в V. холеры8, и побудитель bactofilin CcmA в Helicobacter pylori9 (Рисунок 2).
Локализация белков может дать представление об их функциях. Например, белки, участвующие в делении клеток, обычно локализованы до средней клетки10,11. Высокопроизводительные исследования были проведены для локализации всех белков бактерии в надежде получить представление о своих функциях12. К сожалению, эти исследования были проведены с помощью 2D-изображения и 1D или 2D-анализа, что делает невозможным измерение конкретных аспектов локализации белка, таких как локализация к клеточным геометрическим особенностям.
Например, MreB, динамический белок, необходимый для стержня форму многих бактерий, предполагается работать, направляя локализации синтеза клеточной стенки, и его локализация отражает локализацию синтеза клеточной стенки7,13. MreB от нескольких видов показывает геометрическое обогащение4,6,7,14,15. Динамические поверхностные полимеры, такие как MreB, могут соединить геометрию поверхности с усредненным временем профиля обогащения16 и могут быть в состоянии ориентироваться на конкретные геометрии, минимизируя энергию, связанную с привязкой к мембране17. Хотя важность скручивания, комплектации, изгиба и динамики не была полностью решена для MreB, важно отметить, что точные измерения обоих основных кривизны поверхности требуют полного 3D-представления ячейки. Поэтому для наиболее точного измерения кривизны, к которым локализуются белки, предпочтительнее использовать 3D, а не 2D-изображение. 3D-изображение устраняет необходимость вычислительной оценки тех кривизны, которые не могут быть измерены в 2D, оценка, которая не может быть точной в асимметричных клетках18.
Хотя 2D-изображение клеток происходит быстрее и не требует столько постизображений вычислительной работы, 3D-изображение обеспечивает более точное представление клетки, а также способность измерять поверхностные особенности, такие как кривизна, которая не может быть измерена в 2D. Поэтому, по мере того как 3D изображение будет более обычным, новые проницательности в форму клетки и локализации протеина станут по возможности.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50nm fluorescent beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8795</td>
			<td>these are used to measure the blurring function of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swab</td>
			<td>Puritan Medical Products Company LLC</td>
			<td>S304659</td>
			<td>used to appy VaLaP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc</td>
			<td>used to cro cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LST3166</td>
			<td>membrane dye used to stain cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>Huygens essential or professional</td>
			<td>Use to measure blurring function of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lanolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7387</td>
			<td>combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB growth medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0446173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M63 medium</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>M1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Needed to run forward convolution scripts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nkon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>327212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Equate</td>
			<td>49035-038-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezo z stage</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77011589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet tips -p200</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipet tips- p10</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization

Форма бактерии важна для ее физиологии. Многие аспекты физиологии клеток, такие как подвижность клеток, хищнизание и производство биопленки могут быть затронуты формой клеток. Бактериальные клетки являются трехмерными (3D) объектами, хотя они редко рассматриваются как таковые. Большинство методов микроскопии приводят к двумерным (2D) изображениям, что приводит к потере данных, относящихся к фактической форме 3D-клеток, и локализации белков. Некоторые параметры формы, такие как гауссийская кривизна (продукт двух основных кривизны), могут быть измерены только в 3D, потому что 2D изображения не измеряют обе основные кривизны. Кроме того, не все клетки лежат плоские, когда монтаж и 2D изображения изогнутых клеток не может точно представлять формы этих клеток. Точное измерение локализации белка в 3D может помочь определить пространственную регуляцию и функцию белков. Разработана технология переднего свертывания, которая использует функцию размытия микроскопа для восстановления форм 3D-клеток и точной локализации белков. Здесь описан протокол для подготовки и монтажа образцов для визуализации живых клеток бактерий в 3D как для восстановления точной формы клеток, так и для локализации белков. Метод основан на простой подготовке образца, приобретении флуоресцентного изображения и обработке изображений на основе MATLAB. Многие высококачественные флуоресцентные микроскопы могут быть просто изменены, чтобы принять эти измерения. Эти реконструкции клеток являются вычислительно интенсивными, и рекомендуется доступ к вычислительным ресурсам с высокой пропускной душой, хотя и не является необходимым. Этот метод был успешно применен к нескольким бактериальным видам и мутантам, флуоресцентным методам визуализации и производителям микроскопов.

Бактерии бывают самых разных форм и размеров, которые могут определять их функции в природе1. Результатом этой процедуры является точное 3D-представление ячеек из переднего свертка z-стек изображений(рисунок 1). Этот метод особенно важен при работе с изогнутыми клетками(рисунок 2),или с аномально формы клеток (Рисунок 4A), как 2D представление не отражает кривизны клеток точно. Для того, чтобы использовать метод переднего свертывания(Рисунок 1А),клетки должны быть либо периферийно окрашены или цитоплазматического пятна(Рисунок 2B слева против справа).
На рисунке 4 показана локализация MreB в ячейке. Слияние GFP было сделано для бактериального белка актина MreB21 для того, чтобы изучить его точную локализацию как в диком типе, так и в мутантных клетках кишечной палочки 4. Поскольку MreB связан с мембраной, 3D-изображение требуется для точного воспроизведения своего положения в клетке. Делая эти измерения в 3D, мы смогли реконструировать формы как диких типов, так и стержней мутантных клеток(рисунок 4A). Локализация MreB была показана, чтобы быть обогащенным на небольших гауссианских кривизны, геометрические особенности, которые могут быть измерены только в 3D, в Роде зависимым образом (Рисунок 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig1.jpg"> Рисунок 1: Метод свертывания вперед реконструирует клетки без предварительного знания формы клетки. (A) Окончательный выход метода является реконструкция 3D-клеток, полученных путем сравнения тестовой формы с откалиброванные функции размытия микроскопа. Это сравнивается с наблюдаемым z-стеком до тех пор, пока наблюдаемое 3D-изображение не соподостоит гипотетическому. Показано здесь изображение является визуализацией реконструкции одной ячейки C. crescentus. (B) Конвейер реконструкции итеративно обновляет расчетные позиции поверхностных элементов на основе наблюдаемого стека изображений. Для получения полных алгоритмических деталей метода, см. Nguyen3. (C) Реконструкция трубопровода начинается без априорного знания формы ячейки и обновляет положение и количество поверхностных вершин, чтобы соответствовать наблюдаемым z-стек. Репрезентативные изображения с каждых 30 шагов во время 3D-реконструкции отображаются с трех разных ракурсов клетки V. cholerae. Поверхностные положения этой формы обновляются, чтобы свести к минимуму разницу между смоделированным и наблюдаемым стеками. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig2.jpg"> Рисунок 2: Представитель 3D реконструкций трех различных форм бактериальных видов. Трехмерные реконструкции могут быть сделаны из клеток с их мембраны окрашенных (слева) или заполнены цитоплазматического флюорофора (справа). Форма и кривизна стартовой ячейки не имеет значения, так как изогнутый стержень, витой стержень или прямой стержень все способны быть точно реконструированы. Реконструированные поверхности окрашены на основе местной гауссианской кривизны поверхности. Шкала бар No 1 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig3a.jpg"> Рисунок 3: Реконструкция может вывести из строя по нескольким причинам. Ячейки должны быть проверены, чтобы убедиться, что алгоритм реконструкции сходился с разумным результатом. Слева - представительный дикий тип (вверху) и стержень мутант (внизу) E. coli клетки, которые прошли контроль качества. Правые ячейки, которые не удалось восстановить должным образом и не прошли контроль качества. Показаны пять классов неудачной конвергенции: i) клетки, которые находятся слишком близко к краю области обрезки, что приводит к резкой демаркации, (ii) клетки, которые находятся слишком близко к другой клетке, (iii) клетки, которые произвели divot, (iv) клетки, которые не проследовали мимо первоначального s пункт tarting, и (v) другие неизвестные ошибки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60350/60350fig4.jpg"> Рисунок 4: Репрезентативные данные, показывающие локализацию белка в конкретных клеточных геометриях. (A) Трехмерные реконструированные клетки дикого типа и стержня E. coli клетки с гауссианской кривизны и Мреб флуоресценции интенсивности отображается. Шкала бар No 1 мкм. (B) Обогащение участков MreB от дикого типа и стержня E. coli клеток. Значения, которые показывают обогащение и значения, которые показывают, что MreB из этих клеточных регионов является единым покрытием клетки. Затененные области указывают на средний интервал доверия загрузки 90% среднего. Кривая для каждого штамма является кубической сглаживания сплайдинга и усеченс спомощью порога вероятности для экстремальных кривизны р Эта цифра была изменена с (Bratton et al.) 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60350/60350fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization at JoVE.com

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

В этом протоколе объясняется, как подготовить и смонтировать образцы бактерий для живой трехмерной визуализации и как реконструировать трехмерную форму кишечной палочки из этих изображений.

Трехмерная визуализация бактериальных клеток для точного клеточного представления и точной локализации белка

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Поскольку бактерии настолько малы, люди часто забывают, что они трехмерные объекты. Наш протокол позволяет точно восстановительные формы как плоских, так и изогнутых клеток. Этот протокол требует лишь небольших изменений в стандартный микроскоп, и они легко доступны в сценариях MATLAB.Перед началом эксперимента поместите две стопки каждой из трех 20 на 20 миллиметров крышки скользит на противоположных концах одного стеклянного микроскопа слайд. Pipette 200 микролитров раствора агарозы площадку на слайде и сразу же и твердо место второй слайд на стек крышки скользит, чтобы сгладить агарозу. После разрешения агарозы затвердеть в течение одной минуты при комнатной температуре тщательно соскользнуть верхней слайд и использовать большой конец 200 микролитер пипетки отзыв вырезать отдельные пять миллиметров диаметром колодки из геля.Когда все колодки были получены пипетки E.coli клеточной культуры несколько раз, чтобы нарушить любые клеточные сгустки и обеспечить, чтобы клетки однородно распределены перед добавлением одного микролитер субкультуры на каждой площадке. После сдачи образцов воздух сухой в течение пяти до 10 минут подтверждают, что капли были полностью поглощены в колодки перед размещением крышку скольжения на колодки. Затем используйте ватный тампон, чтобы аккуратно почистить соответствующий герметик по краю крышки скольжения, заботясь, чтобы держать герметик от верхней части крышки скольжения.Сразу же после уплотнения крышки скольжения место слайд на стадии микроскопа и после пяти минут тепловой эквилибрации использовать микроскоп фокус колеса довести середину клетки в центре внимания. В связанном программном обеспечении микроскопа в соответствии с ND Acquisition, проверьте коробку q, чтобы приобрести стек и нажмите кнопку Home, чтобы установить середину ячейки в качестве отправной точки. Установите размер шага до 0,1 микрометра и диапазон до четырех микрометров и убедитесь, что устройство q установлено на сцене Пьезо.Очень важно, чтобы на верхней и нижней части клетки было достаточно размытия, так что клетка почти неотличима от фона. Установите флуоресцентные каналы под окном лямбды в настройки для флуоресцентных молекул, которые будут изображены и подтвердите, что порядок эксперимента установлен на lambda так, что полный стек q будет получен в каждом цветном канале перед переключением. Затем нажмите Run now, чтобы начать приобретение изображения.Когда все изображения были приобретены открыть файлы в соответствующей программе анализа изображений. Нарисуйте коробку вокруг отдельной ячейки и дублируйте эту ячейку два раза, один раз для каждого канала, убедившись, что коробка с гиперстахом Duplicate проверена, и измените канал на один или два. После того, как оба стека доступны, выберите изображения, стеки, инструменты и Concatenate для объединения изображений.С каналом протеина сперва и каналом формы вторым. После сохранения нового изображения в качестве файла TIFF сделайте папку внутри папки на рабочем столе, которая содержит обрезанные изображения и cell_shape_settings_tri. txt файл из ша-клеток-общественных exampleData_tri.Отредактировать cell_shape_settings_tri. txt файл, чтобы иметь правильные настройки для эксперимента интереса. И запустите Cell_shape_detector3dConvTriFolder функцию со строкой в расположение папки, а затем количество ячейки, на которой начать и количество ячеек, которые должны быть запущены.Чтобы подтвердить, что ячейки были должным образом реконструированы запустить ScreenFits. Когда графический пользовательский интерфейс открывается, нажмите кнопку Select Folder и выберите папку с файлами данных реконструкции, чтобы визуально экран отдельных реконструкций ячейки. Для любой ячейки, которая появляется деформированной или которая не имеет полного покрытия, выберите поле рядом с реконструкцией, чтобы прибвести FLAG к имени, чтобы она можно было исключить из любого анализа ниже по течению.Вы запустите enrichmentSmothingSpline, чтобы создать профиль обогащения относительной концентрации белка интереса как функции гауссийской кривизны на поверхности. Затем выберите каждую папку с только что созданным TRI. мат файлы и выбрать вновь созданный файл кривой коврик.Этот метод особенно полезен при работе с изогнутыми или аномально сформированными клетками, так как 2D-представление не может точно отражать кривизну клеток. В этом эксперименте зеленый флуоресцентный синтез белка бактериального белка актина MreB был создан для изучения точной локализации белка актина как в диком типе, так и в мутантных клетках E.coli. Делая эти измерения в 3D захваченных изображений формы как дикого типа и стержня мутантных клеток были в состоянии быть реконструированы.Затем было установлено, что локализация MreB будет обогащена небольшими искривлением Гауссии, геометрической особенностью, которая может быть измерена только в 3D зависимой манере. Не забудьте убедиться, что стек q достаточно велик, чтобы клетки были размыты сверху и снизу и чтобы клетки хорошо отозрались друг от друга. Мы показываем, как измерить геометрическую локализацию белков в 3D, но другая информация может быть рассчитана из этих данных, таких как размер сборки белка тегов.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Оценка устьичного Ответ на живые бактериальные клетки с использованием полного изображения листьев

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Бактериальные изображений<em&gt; В Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Визуализация InlC секрецию по расследованию сотовой инфекции по бактериальным патогеном<em&gt; листерий</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Визуализация взаимодействий белок-ДНК в живых бактериальных клеток с использованием отслеживания одиночных молекул фотоактивируемые

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетках млекопитающих

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Индукция клеточной дифференцировки и визуализации отдельных клеток<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Плоттеры и богомольцы

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

Свет лист микроскопии для трехмерной визуализации иммунных клеток человека

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Этикетка свободной идентификации лимфоцитов подтипы, с использованием трехмерных количественных этап визуализации и машинного обучения

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...