Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

وقد دعمت هذه الدراسة بمنح من المعهد الوطني للسرطان R01-CA172220 (المعمم ، WYH) ، R01-ES02207 (المعمم ، WYH). نشكر النواة تدفق الخلوية في جامعه إلينوي في شيكاغو للحصول علي المساعدة في فرز الخلايا.

وينبغي ان يتم كل مناوله الخلايا والاستعدادات وسائل الاعلام مع تقنيه العقيم في الدرجة الثانية مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (BSC).
1. ثقافة وصيانة خلايا هبريك في 2D
<ol><li>معطف 100 مم الاطباق الثقافية مع 2 مل من 2.5 ميكروغرام/سم2 الفيبرونكتين جنيني الحل بين عشيه وضحيها في درج?...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

تدفق الخلوي باستخدام عده علامات سطح الخلايا الجذعية هو نهج يستخدم عاده للبحوث الخلايا الجذعية علي الرغم من عدم وجود كل من الخصوصية والانتقائية1,5,6. في حين ان تشكيل كروي في نظام ثقافة 3d هو وسيله أخرى مفيده في إثراء الخلايا الجذعية النادرة م...

غده البروستاتا البشرية تحتوي علي ظهاره التلالؤ مع وظيفة سيكريتوري والخلايا القاعدية الكامنة وراء ذلك مع مكون خليه الغدد الصماء العصبية غير عادية. الخلايا الظهاريه ، في هذه الحالة ، يتم إنشاؤها من السكان نادره من الخلايا الجذعية البروستاتا التي هي هادئه نسبيا في الجسم الحي وتعمل كنظام إصلاح للحفاظ علي التوازن الغديه في جميع انحاء الحياة1. وعلي الرغم من العديد من التطورات ، لا يزال تحديد الخلايا الجذعية لبروستاتا وعزلها وظيفيا يشكل تحديا كبيرا في الميدان. ويشيع استخدام الخلايا الجذعية الحيوية ، بما في ذلك المنهجيات القائمة علي علامات سطح الخلية مع قياس التدفق الخلوي لأبحاث الخلايا الجذعية2،3،4. ومع ذلك ، فان النتائج المتعلقة بالإثراء والعزلة تتفاوت علي نطاق واسع باعتبارها داله لمجموعات العلامات وخصوصية الأجسام المضادة5،6، مما يثير تساؤلات حول هويه الخلايا المعزولة. نهج آخر يستخدم علي نطاق واسع لتخصيب الخلايا الجذعية مثل ثلاثي الابعاد (3d) كروي الثقافة2,3,4. في حين ان الخلايا الجذعية المقيمة هي هادئه نسبيا في فيفو مع القيود المتخصصة ، فانها تخضع لانقسام الخلايا في الثقافة مصفوفة 3d (متماثلة وغير متناظرة) ، وتوليد كل من الجذعية وخلايا سلف التي تتكاثر بسرعة نحو النسب التزام7،8. وتشكل الخزان المشكلة خليطا غير متجانس يحتوي علي كل من الخلايا الجذعية وخلايا السلف في مراحل مختلفه من التزام بالنسب ، بما في ذلك الخلايا المبكرة والمتاخره لمرحله السلف. التالي ، فان المقايسات باستخدام الخزان بأكملها ليست الخلية الجذعية الحصرية ، مما يجعل تحديد خصائص الخلايا الجذعية الفريدة غير حاسمه. ولذلك ، فمن المهم لخلق المقايسات لتحديد وفصل الخلايا الجذعية البروستاتا من الأسلاف ابنتهم. وتحقيقا لهذه الغاية ، فان الهدف من البروتوكول الحالي هو إنشاء نظام فحص يسمح بالتحديد والعزل الفعالين للخلايا الجذعية من انسجه البروستاتا البشرية يعقبه تحليل قوي لمجري الهواء لوظائفها البيولوجية.
علي المدى الطويل 5-برومو-2 '-ديوكسيريدين (brdu) التسمية-الاحتفاظ يستخدم علي نطاق واسع لفي الجسم المجري والمختبر تتبع سلاله من الخلايا الجذعية علي أساس وقت المضاعفة لفترات طويلة9,10. ويستند النهج الحالي لتحديد الخلايا الجذعية البروستاتا والعزلة الموصوفة هنا علي خصائصها النسبية هادئه وخاصيه الاحتفاظ بالتسمية داخل السكان الظهاريه مختلطة. وعلاوة علي ذلك ، استنادا إلى فرضيه الحمض النووي الخالدة حبلا ، يمكن فقط الخلايا الجذعية الخضوع لانقسام الخلايا غير المتناظرة. الخلية الجذعية تمثل خليه ابنه التي تحتوي علي الحمض النووي الابويه القديمة في حين ان خليه السلف ، وهي خليه ابنه الملتزمة ، يتلقى الحمض النووي توليفها حديثا. يتم استغلال خاصيه الخلايا الجذعية الفريدة الموصوفة أعلاه لتنفيذ وسم BrdU في الخلايا الجذعية الابويه في الثقافات الاوليه ومن ثم تتبع علامتها بعد الانتقال إلى الثقافة الكروية الخالية من المرساة. في حين ان معظم الخلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه تحتفظ القاعدية والعابرة تضخيم النمط الظاهري في الثقافة 2d, وهناك أيضا عدد نادر من الخلايا الجذعية متعددة القوية تجديد والحفاظ علي التوازن الظهاريه كما يتضح من تشكيل خزان أو العضوية المتمايزة تماما مع وسائل الاعلام ثقافة المقابلة عند نقل إلى 3d أنظمه3,12 في البروتوكول الحالي لدينا ، باستخدام هبريك خزان البروستاتا أو بروستاسفيري القائم علي BrdU ، CFSE ، أو الأحمر البعيد اختبارات الاستبقاء تليها الفرز الخلية المنشطة فلوري (FACS) ، ونحن تحديد الخلايا الجذعية الاحتفاظ بالتسمية في خزان علي مستوي خليه واحده13.
والاهم من ذلك ، أكدنا كذلك خصائص الخلايا الجذعية للخلايا المحتفظة بالملصقات في المرحلة المبكرة من الخزان بالمقارنة مع خلايا السلف التي لديها التزام بالنسب. وتشمل هذه الانقسام الخلايا الجذعية غير المتماثلة, في المختبر القدرة علي تكوين كروي وفي الجسم الحيوي تجديد القدرات, النشاط الغيار التلقائية مرتفعه, التكوين الإحيائي المعزز وانخفاض النشاط الأيضي. وفي وقت لاحق ، اجري تحليل RNAseq. ولوحظت الجينات بشكل مختلف في الخلايا الكروية الاحتفاظ التسمية التي قد تكون بمثابه العلامات الحيوية الجديدة للخلايا الجذعية البروستاتا البشرية. وهذا النهج القائم علي التسمية القائمة علي الكروي يمكن ان ينطبق علي عينات السرطان لتحديد عدد صغير من الخلايا السرطانية مثل الجذعية ، التالي توفير فرص انتقاليه لأداره السكان مقاومه العلاجية13. ويرد أدناه اختبار الاحتفاظ بالتسمية القائم علي بروستاسفيري باستخدام خلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه البشرية (هبريك) كمثال.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

وعلي الرغم من التقدم المحرز في بحوث الخلايا الجذعية البالغة ، لا يزال تحديد وعزل الخلايا الجذعية من عينات الانسجه يشكل تحديا كبيرا. في حين ان الخلايا الجذعية المقيمة هي هادئه نسبيا مع القيود المتخصصة في انسجه الكبار ، فانها تدخل دوره الخلية في الثقافة الثلاثية الابعاد (3D) خاليه من المرساة والخضوع لانقسام الخلايا المتناظرة وغير المتناظرة ، مما يؤدي إلى كل من الجذعية والسلف الخلايا. وتتكاثر هذه الاخيره بسرعة وتشكل الخلية الرئيسية في مراحل مختلفه من التزام بالنسب ، وتشكل خزان غير متجانسة. باستخدام الخلايا الظهاريه البشرية العادية الاساسيه البروستاتا (هبريك) ، تم تطوير الفحص القائم علي الكروي ، والاحتفاظ بالعلامات التي تسمح بتحديد وعزل وظيفي للخلايا الجذعية كروي البدء في قرار خليه واحده.
هبريك أو خطوط الخلايا هي ثنائيه الابعاد (2D) مثقف مع BrdU لمده 10 أيام للسماح بدمجها في الحمض النووي لجميع الخلايا الفاصلة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية تجديد الذاتي. تبدا الغسيل عند الانتقال إلى الثقافة ثلاثية الابعاد لمده 5 أيام ، وخلالها تجدد الخلايا الجذعية ذاتيا من خلال التقسيم غير المتناظر والبدء في تكوين كروي. بينما الخلايا الجذعية ابنه هادئه نسبيا الاحتفاظ بالحمض النووي الأبوي المسمي BrdU ، والأسلاف ابنه تتكاثر بسرعة ، وفقدان التسمية BrdU. ويمكن استبدال BrdU مع CFSE أو الأحمر البعيد الموالية للاصباغ ، والتي تسمح الحية عزل الخلايا الجذعية من قبل FACS. وأكدت خصائص الخلايا الجذعية من قبل في تشكيل كروي المختبر, في اختبارات تجديد الانسجه الجسم الحيوي, وعن طريق توثيق الانقسامات المتماثلة/غير متناظرة الخلايا. يمكن استجواب الخلايا الجذعية المعزولة التي تحتفظ بالملصقات بدقه من خلال الدراسات الجزيئية والبيولوجية المصب ، بما في ذلك الحمض الريبي المتسلسل ، ورقاقه-seq ، والتقاط الخلايا المفردة ، والنشاط الأيضي ، وتنميط البروتين ، والمناعة المناعية ، وتشكيل الانسجه والاهم من ذلك ، فان نهج عزل الخلايا الجذعية الوظيفية الخالي من العلامات يحدد الخلايا الجذعية من عينات السرطان الطازجة وخطوط الخلايا السرطانية من أجهزه متعددة ، مما يوحي بامكانيه تطبيقها علي نطاق واسع. ويمكن استخدامه لتحديد سرطان الخلايا الحيوية مثل الجذع الجذعية ، والادويه الشاشة التي تستهدف الخلايا السرطانية مثل الجذعية ، واكتشاف الأهداف العلاجية الجديدة في السرطان.

يتم وضع الاساسيه الطبيعية البروستاتا البشرية الخلايا الظهاريه في الاطباق الثقافة المغلفة fibronectin ويتم الحفاظ علي نمو الخلايا في الثقافة 2D (الشكل 1ا). عند نقلها إلى ثقافة 3D مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، والخلايا الظهاريه المتمايزة يموت ببطء. فقط الخلايا الجذعية ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

باستخدام خلايا الظهاريه البروستاتا الاوليه البشرية ، ونحن الإبلاغ عن طريقه جديده خاليه من العلامات الحيوية من توصيف وظيفية للخلايا مثل الجذعية بواسطة كروي القائم علي التسمية الاحتفاظ الفحص. يتم وصف بروتوكول خطوه بخطوه ل BrdU ، CFSE ، أو الأحمر البعيد وضع العلامات خليه 2D ؛ تشكيل كروي ثلاثي الابعاد ؛ التسمية الاحتفاظ الجذعية مثل الخلية تحديد من قبل الكيمياء المناعية; والعزلة من قبل FACS.

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

ولا تزال عزلة الخلايا الجذعية تشكل تحدياً كبيراً بسبب العزلة المشتركة للخلايا السلف باستخدام الطرق الحالية. طورنا مقايسة خالية من العلامات الحيوية الجديدة لعزل الخلايا الجذعية هادئة من السلف المختلطة. الميزة الرئيسية لهذا على أساس spheroid، التسمية الاحتفاظ المقايسة، فإنه يمكن توسيع وعزل الخلايا الجذعية الحية من ذرية ابنتهم من قبل FACS باستخدام CFSE أو أقصى الأحمر وضع العلامات.في حين أن العلاجات التقليدية تقضي على معظم خلايا سرطان البروستاتا، فإن الخلايا الجذعية السرطانية تظل بسبب المقاومة العلاجية، مما يؤدي إلى تطور المرض. وستتيح عزل الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية تحديد الجينات الجديدة التي يمكن استهدافها بشكل علاجي مشترك من أجل مغفرة فعالة للمرض. لدينا تصنيف الاحتفاظ بالتسمية للتطبيق لعزل الخلايا الجذعية الطبيعية من الأنسجة والخلايا المختلفة، وأبحاث الخلايا الجذعية السرطانية.الأهم من ذلك، هذا الفحص ينطبق على سرطانات الخلايا الظهارية الأخرى، مثل سرطان الثدي وسرطان القولون والمستقيم. تبدأ من خلال طلاء الأطباق ثقافة 100 ملليمتر مع ملليلتر اثنين من 2.5 ميكروغرام فيبرومينكين الحل واحتضان لهم بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ثم الطامح الحل والسماح للأطباق الثقافة الهواء الجاف في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة.أضف تسعة ملليلترات من نمو الخلايا الظهارية في البروستاتا متوسطة إلى طبق مغلف بالليفية وأبقيه دافئًا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. ذوبان قارورة واحدة من الخلايا الظهارية البروستاتا البشرية المجمدة في حمام الماء 37 درجة مئوية، وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المتوسطة الدافئة. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق.ثم تُفطّن وتُنبذ المُندفع. resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة ثقافة دافئة ونقل ملليلتر واحد من التعليق مباشرة إلى طبق ليفية المغلفة مع المتوسطة قبل الدافئة. ثم احتضان الطبق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية.إذا كان co-labeling الخلايا، إعداد الخلايا التي تحمل اسم BrdU في 10 أيام 2D الثقافة كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم إضافة خمسة ميكرومولار CFSE أو أحمر الأقصى واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، تعرق بعناية المتوسطة مع الصبغة وغسل الخلايا مرتين مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني دافئ.بعد ذلك، قم بإجراء الهضم الأنزيمي مع 05٪ تبسين EDTA وفقا لاتجاهات المخطوطة. الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من افر. تم إعادة وضع الخلايا في الجليد الباردة ، واحد إلى واحد مصفوفة غشاء الطابق السفلي والثقافة المتوسطة مزيج لتشكيل 3D اسطاتوسفير.لإعداد ثقافة شطلاف الفينيل في نظام مصفوفة 3D الطابق السفلي، ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها والاحتفاظ بها على الجليد قبل استخدامها. ثم يضاف بلطف ملليلتر واحد من الجليد الباردة مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى حجم متساو من الجليد الباردة ثقافة المتوسطة. الماصات صعودا وهبوطا لخلط، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء.Resuspend خمس مرات 10 إلى 1/4 خلايا ظهارية البروستاتا البشرية في الجليد الباردة واحد إلى واحد مصفوفة غشاء الطابق السفلي والثقافة مزيج وسائل الإعلام لحجم إجمالي 500 ميكرولترات. الماصات الحل إلى الحافة السفلية من كل بئر ودوامة لوحة لتوزيع الخليط بالتساوي. ضع الطبق في حاضنة لثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للمصفوفة بتجمدها.ثم تغطية مع ملليلتر واحد من ثقافة دافئة المتوسطة في بئر، والتأكد من عدم إزعاج الحلبة. لحصاد prostaspheres المسمى CFSE استبدال المتوسطة مع اثنين من millilits dispalits والماصات صعودا وهبوطا لخلط عدة مرات. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم المصفوفة، ثم جمع خليط الكرة في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.الطرد المركزي في المجالات 500 مرة ز لمدة خمس دقائق والتخلص من الفائق. إعادة تعليق بيليه في 500 ميكرولترات من 05٪ التربسين EDTA الدافئة، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر. احتضان المجالات في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم إضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني دافئ مع 10٪FBS.مررها من خلال حقنة ذات ملليلتر واحدة بإبرة قياس 26 لتفكّك المجالات تمامًا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. ثم تُفطّن وتُنبذ المُندفع.Resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من متوسطة الثقافة الدافئة مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر بروبديسيوم يوديد لطخة الخلايا الميتة واحتضانها لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. كرر الطرد المركزي، وتجاهل المابير. ثم يغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من المتوسطة الدافئة.كرر الطرد المركزي، وتجاهل المابير. Resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من ثقافة دافئة المتوسطة وجمع الخلايا في أنابيب أسفل البوليسترين جولة خمسة ملليلتر عن طريق تصفية لهم من خلال 35 ميكرون المسام حجم سلالات الخلايا المفاجئة. إجراء تحليل FACS لخلايا بروتسين مُوزعة بـ CFSE التي تحمل اسم "بروستاسفير".باستخدام الخلايا غير المسماة كتحكم سالب والخلايا المسماة بCFSE كتحكم إيجابي لتعيين البوابات، قم بتشغيل العينة لفرز وتجميع الشعـب الفرعية لخلايا CFSE-high وCFSE-low. تم وضع الخلايا الظهارية الأساسية البشرية العادية في أطباق الثقافة المغلفة بالفيبينينستين وتم الحفاظ على نمو الخلايا في الثقافة 2D. عند نقلها إلى ثقافة ثلاثية الأبعاد مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، ماتت الخلايا الظهارية المتمايزة ببطء ولم يبق سوى الخلايا الجذعية البروستاتا.وأظهرت العلامات المزدوجة للخلايا الظهارية البروستاتا في ثقافة 2D تليها تشكيل كروي في ثقافة 3D كولوكاليسي من BrdU، CFSE، وأحمر فار في نفس الخلايا التسمية الاحتفاظ. وأظهرت ازدواجية المناعة أن الخلايا الاحتفاظ التسمية تحمل مستويات أقل من بروتين السيتوكيراتين الكيراتين 14، وانخفاض بروتين تقاطع الخلايا E-cadherin، وزيادة البروتينات علامة الخلايا الجذعية في وقت مبكر Wnt10b و ALDH1A1، وزيادة بروتين autophagy LC3، وزيادة myosin IIB. وعلاوة على ذلك، فإن مقايسة التسمية القائمة على اللصق، تكتشف بنجاح الخلايا الجذعية السرطانية الشبيهة في عينات سرطان البروستاتا.عرضت CFSE المسمى الاحتفاظ بالخلايا السرطانية الشبيهة بالربع والزى المشتقة من عينات سرطان البروستاتا البشرية بروتين E-cadherin المنخفض نسبة إلى الخلايا السلف غير المسماة. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم الحفاظ على مصفوفة في شكل سائل لإعداد الثقافة المتوسطة. تخزينه بين عشية وضحاها في أربع درجات، ونصائح ماصة البرد في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة قبل الاستغناء عن مصفوفة.بعد عزل الخلايا الجذعية باستخدام مقايسة الاحتفاظ بالتسمية القائمة على الرفو، يمكن إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وتحليل البروتيوم لتحديد جينات محددة وعلامات حيوية جديدة في الخلايا الجذعية. إن عزل الخلايا الجذعية السرطانية الحية من خلال فحص الاحتفاظ بالتسمية القائم على الزاوي يجعل من الممكن للباحثين زراعة الأورام المشتقة من الخلايا الجذعية السرطانية في المختبر وفحص الأدوية الجديدة المضادة للسرطان.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

إنشاء السرطان الجذعية الثقافات خلية من ساركوما العظام التقليدية الإنسان

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

الإعداد والتحليل الأيضي الثقافات المشارك كروي ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

مقايسة قتل كروي من خلايا تي السيارة

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

اكتشاف جينات السائق في الخلايا القولونية HT29 المشتقة من السرطان الجذعية مثل الأورام

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...