Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Vi takker Flowcytometry Core ved University of Illinois i Chicago for assistance til celle sortering.

Alle celle håndterings-og medie præparater skal udføres med aseptisk teknik i et biologisk sikkerhedskabinet i klasse II.
1. kultur og vedligeholdelse af HPrEC-celler i 2D
<ol><li>Coat 100 mm kultur retter med 2 ml 2,5 μg/cm2 fibronektin opløsning natten over ved stuetemperatur (RT). Aspirer opløsningen og lad kultur retterne lufttørre i BSC for 45 min. Fibronectin-belagte kultur retter kan opbevares 2 – 4 uger ved 4 °C.</li>
	<li>Tilsæt 9 mL prostata epitel cellevækst...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

Flow cytometri ved hjælp af flere stamcelle overflade markører er en almindeligt anvendt tilgang til stamcelleforskning trods manglende både specificitet og selektivitet1,5,6. Mens sfæroide dannelse i et 3D-kultur system er en anden nyttig metode til at berige den sjældne stamcelle population fra primære epitelceller, herunder hprec, er de resulterende sfæroider stadig en heterogen blanding af Stam-og progenitorceller<sup...

Den menneskelige prostata indeholder luminale epitel med sekretoriske funktion og basal celler underliggende det sammen med en usædvanlig neuroendokrine celle komponent. Epitelcellerne, i dette tilfælde, er genereret fra en sjælden population af prostata stamceller, der er relativt latent in vivo og fungere som et reparationssystem til at opretholde glandulær homøostase hele livet1. Trods mange fremskridt er identifikationen og den funktionelle isolation af prostata stamceller fortsat en stor udfordring i marken. Stamcelle-biomarkører, herunder celleoverflade markerings baserede metoder kombineret med flowcytometri, anvendes almindeligvis til stamcelleforskning2,3,4. Men, resultater for tilsætning og isolation varierer meget som en funktion af markør kombinationer og antistof specificitet5,6, at rejse spørgsmål om identiteten af de isolerede celler. En anden meget udbredt tilgang til Stem-lignende celle berigelse er tredimensionel (3D) sfærisk kultur2,3,4. Mens residente stamceller er relativt latent in vivo med niche begrænsninger, gennemgår de celle opdeling i 3D Matrix kultur (både symmetrisk og asymmetrisk), genererer både stamceller og progenitorcellerne, der hurtigt gengiver mod Lineage engagement7,8. De dannede sfæroider er en heterogen blanding, der indeholder både stamceller og progenitorceller på forskellige stadier af lineært engagement, herunder tidlige og sene progenitorceller. Således er assays ved hjælp af hele sfæroider ikke stamcelle eksklusiv, hvilket gør identifikationen af unikke stamcelle egenskaber inkonklusive. Derfor er det afgørende at skabe assays at identificere og adskille prostata stamceller fra deres datter forfædre. Med henblik herpå er målet med den nuværende protokol at etablere et analyse system, der giver mulighed for effektiv identifikation og isolering af stamceller fra humant prostata væv efterfulgt af en robust downstream-analyse af deres biologiske funktioner.
Langsigtet 5-Bromo-2'-deoxyuridin (brdu) etiket-retention er meget udbredt til in vivo og in vitro-Lineage sporing af stamceller baseret på deres langvarige fordoblings tiden9,10. Den nuværende fremgangsmåde for identifikation og isolering af prostata stamceller er baseret på deres relative, karakteristiske og mærkelige egenskaber i en blandet epitelial population. Desuden er det kun stamceller, som er baseret på den udødelige streng DNA-hypotese, som kan gennemgå asymmetrisk celledeling. Stam cellen repræsenterer den datter celle, der indeholder det ældre forældre-DNA, mens progenitorcellen, som er en engageret datter celle, modtager det nyligt syntetiserede DNA. Den unikke stamcelle egenskab, der er beskrevet ovenfor, udnyttes til at udføre brdu-mærkning i forældre stamceller i primære kulturer og derefter spore deres etiket efter brdu-washout ved overførsel til 3D Anchor-fri sfæroide-kultur. Mens størstedelen af primære prostata epiteliale celler bevarer en basal og transit forstærker fænotype i 2D-kultur, er der også en sjælden population af Multipotente stamceller, som genopfylder og vedligeholder epitelial homøostase som det fremgår af dannelsen af sfæroider eller fuldt differentierede organoider med tilsvarende dyrkningsmedier ved overførsel til 3D-systemer3,12. I vores nuværende protokol, ved hjælp af HPrEC prostata sfæroider eller prostasphere-baserede BrdU, CFSE, eller langt røde retention assays efterfulgt af fluorescens aktiverede celle sortering (FACS), identificerer vi etiket-fastholdelse stamceller i sfæroider på et enkelt celleniveau13.
Det er vigtigt, at vi yderligere bekræftede stamcelle egenskaberne for etiket bevarende celler i tidlige stadier af sfæroider sammenlignet med progenitorcellerne med lineært engagement. Disse omfatter stamcelle asymmetrisk division, in vitro sfærisk dannelse evne og in vivo vævsregenerering kapacitet, forhøjet autophagy aktivitet, Augmented ribosom Biogenese og nedsat metabolisk aktivitet. Efterfølgende blev der udført RNAseq-analyse. Differentielt udtrykte gener i etiket-fastholdelse sfæide celler blev observeret, der kan tjene som nye biomarkører for humane prostata stamceller. Denne spheroid-baserede etiket-fastholdelse tilgang kan gælde for kræft prøver til tilsvarende identificere et lille antal kræft stamceller, hvilket giver translationelle muligheder for at forvalte de terapeutiske resistente populationer13. Præsenteret nedenfor er prostasphere-baseret etiket-retention assay ved hjælp af humane primære prostata epiteliale celler (HPrEC) som et eksempel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

Trods fremskridt inden for forskning i voksne stamceller er identifikation og isolering af stamcellerne fra vævsprøver fortsat en stor udfordring. Mens residente stamceller er relativt latent med niche begrænsninger i voksent væv, kommer de ind i cellecyklussen i anker-fri tredimensionel (3D) kultur og gennemgår både symmetrisk og asymmetrisk celledeling, hvilket giver anledning til både Stam-og progenitorceller Celler. Sidstnævnte prolifererer hurtigt og er den største cellepopulation på forskellige stadier af Lineage engagement, danner heterogene sfæroider. Ved hjælp af primære normale humane prostata epiteliale celler (HPrEC), en spheroid-baseret, etiket-retention assay blev udviklet, der tillader identifikation og funktionel isolering af spheroid-initierende stamceller ved en enkelt celle opløsning.
HPrEC eller cellelinjer er to-dimensionelt (2D) kultiveret med BrdU i 10 dage for at tillade dets inkorporering i DNA af alle skille celler, herunder selvfornyende stamceller. Skyl ud begynder ved overførsel til 3D-kulturen i 5 dage, hvor stamceller selv fornyer gennem asymmetrisk division og initierer sfærisk dannelse. Mens relativt latent datter stamceller bevarer brdu-mærket forældrenes DNA, er datter forfædre hurtigt prolifererende, mister brdu etiketten. BrdU kan erstattes med CFSE eller langt røde Pro-farvestoffer, som tillader levende stamcelle isolation af FACS. Stamcelle egenskaberne bekræftes ved in vitro-sfærisk dannelse, in vivo-vævs regenererings analyser og ved at dokumentere deres symmetriske/asymmetriske celle opdelinger. De isolerede etiket-holde stamceller kan blive nøje afhørt af downstream-molekylære og biologiske undersøgelser, herunder RNA-SEQ, ChIP-SEQ, enkelt celle opsamling, metabolisk aktivitet, proteom profilering, immunocytokemi, organoid dannelse og in vivo vævsregenerering. Det er vigtigt, at denne markør frie funktionelle stamcelle isolations tilgang identificerer Stam lignende celler fra friske kræft prøver og kræft cellelinjer fra flere organer, hvilket tyder på bred anvendelighed. Det kan bruges til at identificere kræft stamme-lignende celle biomarkører, skærm lægemidler rettet mod kræft Stem-lignende celler, og opdage nye terapeutiske mål i kræft.

Primære normale humane prostata epiteliale celler er placeret i fibronectin-coated kultur retter og cellevækst vedligeholdes i 2D kultur (figur 1a). Ved overførsel til 3D-kultur med en kælder membran matrix, er differentierede epiteliale celler langsomt uddø. Kun prostata stamceller kan overleve i en anker-fri kultur og danne sfæroider i 5 dage (figur 1b).
Dobbelt mærkning af prostata epitelial...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Ved hjælp af humane primære prostata epiteliale celler, rapporterer vi en roman biomarkør-fri metode til funktionel karakterisering af Stem-lignende celler ved en spheroid-baseret etiket-retention assay. En trin-for-trin-protokol er beskrevet for BrdU, CFSE eller langt rødt 2D-celle mærkning; tredimensionel sfærisk dannelse; etiket-fastholde Stem-lignende celle identifikation ved immunocytochemistry; og isolation af FACS.

Isolering af Stem-lignende celler fra 3-dimensionelle sfæriske kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Stamcelleisolering er fortsat en stor udfordring på grund af co-isolation af stamcelleceller ved hjælp af nuværende metoder. Vi udviklede en ny biomarkørfri analyse for at isolere stamceller fra blandede stamfader. Den største fordel ved denne sfæroid-baserede, label-retention assay, det kan udvide og isolere levende stamceller fra deres datter stamfader ved FACS ved hjælp af CFSE eller Far Red mærkning.Mens konventionelle behandlinger udrydde de fleste prostatakræftceller, kræft stamceller forbliver på grund af terapeutisk resistens, og dermed kørsel sygdomsprogression. Stamcelleisolering vil gøre det muligt at identificere nye gener, der kan være terapeutisk målrettet for effektiv sygdomsremission. Vores label-retention assay er gældende for normal stamcelle isolation fra forskellige væv og celler, og for kræft stamcelleforskning.Vigtigere, denne analyse gælder for andre epitelcellekræft, såsom bryst-og kolorektal cancer. Begynd med belægning 100-millimeter kultur retter med to milliliter 2,5 mikrogram fibronectin opløsning og inkubere dem natten over ved stuetemperatur. Derefter aspirere opløsningen og lad kulturretterne lufttørre i biosikkerhedsskabet i 45 minutter.Tilsæt ni milliliter af prostata epitelcellevækstmedium til en fibronectin-belagt skål og holde det varmt i kuldioxid inkubator på 37 grader Celsius. Tø et hætteglas af frosne menneskelige prostata epitelceller i en 37 grader Celsius vandbad, og resuspend cellerne i 10 milliliter varmt medium. Centrifuge celle suspensionen ved 500 gange g i fem minutter.Derefter aspirere og kassér supernatant. Cellerne opsenders igen i en milliliter varmt kulturmedium, og overfør en milliliter af suspensionen direkte til den fibronectinbelagte skål med det forvarmte medium. Derefter inkuberes skålen i kuldioxidinkubatoren ved 37 grader Celsius.Hvis cellerne er co-labeling, skal du forberede BrdU-mærkede celler i 10-dages 2D-kultur som beskrevet i tekstmanuskriptet. Derefter tilsættes fem mikromolar CFSE eller Far Red og inkuber cellerne i 30 minutter. Efter inkubationen skal mediet forsigtigt aspireres med farvestoffet og cellerne vaskes to gange med fem milliliter varm PBS.Dernæst udføre enzymatisk fordøjelse med 05% trypsin EDTA i henhold til manuskriptet retninger. Centrifuge cellerne ved 500 gange g i fem minutter og kassér supernatanten. Celler blev resuspended i iskold, en-til-en kælder membran matrix og kultur medium mix for 3D prostasphere dannelse.For at forberede prostasphere kultur i en 3D kælder matrix system, tø kælderen membran matrix på fire grader Celsius natten over og holde det på is før brug. Derefter forsigtigt tilføje en milliliter iskold kælder membran matrix i en lige stor mængde iskold kultur medium. Pipette op og ned for at blande, idet man skal passe på ikke at indføre luftbobler.Resuspend fem gange 10 til 1/4 human prostata epitelceller i iskold en-til-en kælder membran matrix og kultur medier mix for samlede volumen på 500 mikroliter. Pipette opløsningen til den nederste kant af hver brønd og hvirvle pladen til jævnt distribuere blandingen. Placer pladen i en 37 grader Celsius kuldioxid inkubator i 30 minutter for at tillade matrix at størkne.Derefter dække det med en milliliter varm kultur medium pr godt, og sørg for ikke at forstyrre ringen. For at høste cfse-mærkede prostaspherer erstatte medium med to milliliter dispase og pipette op og ned for at blande flere gange. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i 30 minutter for at fordøje matrixen, og opsam derefter kugleblandingen i et 15-milliliter centrifugerør.Centrifuge kuglerne ved 500 gange g i fem minutter og kassér supernatanten. Opslæm pellet i 500 mikroliter af varm 05% trypsin EDTA, og overføre dem til en 1,5-milliliter centrifuge rør. Inkuber kuglerne ved 37 grader Celsius i fem minutter, og tilsæt derefter 500 mikroliter varm PBS med 10% FBS.Før dem gennem en en-milliliter sprøjte med en 26-gauge nål til helt at adskille kuglerne. Centrifuge cellerne ved 500 gange g i fem minutter. Derefter aspirere og kassér supernatant.Cellerne opvarmes igen i en milliliter varmkulturmed et mikrogram pr. milliliter propidium iodid for at plette de døde celler og inkubere dem i et minut ved stuetemperatur. Gentag centrifugering, og kassér supernatanten. Derefter vaskes cellerne med en milliliter varmt medium.Gentag centrifugering, og kassér supernatanten. Resuspend cellerne i en milliliter varm kultur medium og indsamle cellerne i fem-milliliter polystyren runde bundrør ved at filtrere dem gennem 35-mikron pore størrelse celle si snap caps. Udfør FACS analyse af trypsin-dispergeret CFSE-mærket prostasphere celler.Brug af ikke-mærkede celler som en negativ kontrol og CFSE-mærkede celler som en positiv kontrol for at indstille portene, køre prøven for at sortere og indsamle delpopulationer af fraktioneret CFSE-høj og CFSE-lav celler. Primære normale menneskelige prostata epitelceller blev placeret i fibronectin-belagt kultur retter og cellevækst blev opretholdt i 2D kultur. Ved overførsel til en 3D-kultur med en kældermembranmatrix uddøde differentierede epitelceller langsomt, og der var kun prostatastamceller tilbage.Dual-mærkning af prostata epitelceller i 2D-kultur efterfulgt af sfæroide dannelse i 3D-kultur viste colocalization af BrdU, CFSE, og Far Red i samme etiket-fastholde celler. Dobbelt immunstaining viste, at etiketbeholdende celler udviser lavere niveauer af cytokeratin protein keratin 14, nedsat celle junction protein E-cadherin, øget stamcelle tidlig markør proteiner Wnt10b og ALDH1A1, øget autofagiprotein LC3, og øget myosin IIB. Endvidere, den sfæroide-baserede, label-retention assay held registrerer kræft stamceller-lignende celler i prostatakræft prøver.CFSE-mærket fastholde stamceller-lignende kræftceller og sfæroider stammer fra human prostatakræft prøver udstillet reduceret E-cadherin protein i forhold til de ikke-mærkede stamcelleceller. Når du forsøger denne protokol, er det vigtigt at opretholde matrix i flydende form til kultur medium forberedelse. Opbevar den natten over ved fire grader, og chill pipettespidser i iskold PBS før dispenseringsmatrixen.Efter isolering af stamceller ved hjælp af sfæroid-baserede label-retention assay, encellet RNA sekventering og proteomisk analyse kan udføres for at identificere specifikke gener og nye biomarkører i stamceller. Isolering af levende kræft stamceller ved sfæroid-baserede label-retention assay gør det muligt for forskere at dyrke kræft stamceller-afledte tumoroider in vitro og til at screene nye anti-cancer narkotika.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Etablering af Cancer Stem Cell Cultures fra Menneskelig Konventionel Osteosarkom

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Ved hjælp af Functional Genomics Screening at identificere potentielt nyt lægemiddel mod cancer Cell sfæroide Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Forberedelse og metaboliske analyse af 3-dimensionelle klumpformet Co kulturer af kræft i bugspytkirtlen celler og fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering af menneskelige endotelceller fra normale kolon og Colorectal karcinom - en forbedret protokol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En klumpformet drab Assay af bil T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Efterligne og manipulere med pancreas Acinar til duktalt metaplasi i 3-dimensionelle cellekultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering cellelevedygtighed og død i 3D Spheroid kulturer af kræftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Opdagelsen af Driver Gener i Kolorektal HT29-afledt Cancer Stem-Lignende Tumorsfærer

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...