Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
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Diese Studie wurde durch Stipendien des National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH) unterstützt. Wir danken dem Flow Cytometry Core an der University of Illinois in Chicago für die Unterstützung bei der Zellsortierung.

Alle Zellhandhabungs- und Medienpräparate sollten mit aseptischer Technik in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II (BSC) durchgeführt werden.
1. Kultur und Pflege von HPrEC-Zellen in 2D
<ol><li>100 mm Kulturgerichte mit 2 ml 2,5 g/cm2 Fibronectinlösung über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichten. Die Lösung ansaugen und die Kulturgerichte im BSC 45 min lufttrocknen lassen. Fibronectin-beschichtete Kulturgerichte können 2–4 Wochen bei 4 °C gelagert werden....

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

Die Durchflusszytometrie mit mehreren Stammzelloberflächenmarkern ist ein häufig verwendeter Ansatz für die Stammzellforschung, obwohl es an Spezifität und Selektivität1,5,6fehlt. Während die Sphäroidbildung in einem 3D-Kultursystem eine weitere nützliche Methode zur Anreicherung der seltenen Stammzellpopulation aus primären Epithelzellen, einschließlich HPrEC, ist, sind die resultierenden Sphäroide immer noch eine he...

Die menschliche Prostata enthält luminale Epithel mit sekretorische Funktion und Basalzellen, die ihm zusammen mit einer ungewöhnlichen neuroendokrinen Zellkomponente zugrunde liegen. Die Epithelzellen werden in diesem Fall aus einer seltenen Population von Prostatastammzellen erzeugt, die in vivo relativ still sind und als Reparatursystem fungieren, um die Drüsenhomöostase im Laufe des Lebens aufrecht zu erhalten1. Trotz vieler Fortschritte bleibt die Identifizierung und funktionelle Isolierung von Prostatastammzellen eine große Herausforderung auf dem Gebiet. Stammzell-Biomarker, einschließlich zelloberflächenmarkerbasierter Methoden in Kombination mit Durchflusszytometrie, werden häufig für die Stammzellforschung2,3,4verwendet. Die Ergebnisse für die Anreicherung und Isolierung variieren jedoch stark als Funktion von Markerkombinationen und Antikörperspezifität5,6, was Fragen über die Identität der isolierten Zellen aufwirft. Ein weiterer weit verbreiteter Ansatz zur stammartigen Zellanreicherung ist die dreidimensionale (3D) Sphäroidkultur2,3,4. Während ansässige Stammzellen in vivo mit Nischenbeschränkungen relativ still sind, durchlaufen sie eine Zellteilung in der 3D-Matrixkultur (sowohl symmetrisch als auch asymmetrisch) und erzeugen sowohl Stamm- als auch Vorläuferzellen, die sich schnell zur Abstammungsverpflichtung7,8vermehren. Die gebildeten Sphäroide sind eine heterogene Mischung, die sowohl Stammzellen als auch Vorläuferzellen in verschiedenen Stadien der Abstammungsverpflichtung enthält, einschließlich Früh- und Spätstadium-Vorläuferzellen. So sind Assays mit den gesamten Sphäroiden nicht stammzellexklusiv, was die Identifizierung einzigartiger Stammzelleigenschaften unschlüssig macht. Daher ist es wichtig, Assays zu erstellen, um Prostatastammzellen zu identifizieren und von ihren Tochtervorläufern zu trennen. Zu diesem Zweck besteht das Ziel des aktuellen Protokolls darin, ein Assay-System zu etablieren, das eine effiziente Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus menschlichen Prostatageweben ermöglicht, gefolgt von einer robusten nachgelagerten Analyse ihrer biologischen Funktionen.
Langfristige 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) Etikettenretention ist weit verbreitet für in vivo und In-vitro-Lineage-Tracing von Stammzellen auf der Grundlage ihrer verlängerten Verdoppelungszeit9,10. Der aktuelle Ansatz zur Identifizierung und Isolierung von Prostatastammzellen basiert auf ihren relativen Ruhecharakteristik- und Beschriftungsretentionseigenschaften innerhalb einer gemischten Epithelpopulation. Darüber hinaus können auf der Grundlage der unsterblichen Strang-DNA-Hypothese nur Stammzellen asymmetrische Zellteilung durchlaufen. Die Stammzelle stellt die Tochterzelle dar, die die ältere elterliche DNA enthält, während die Vorläuferzelle, die eine engagierte Tochterzelle ist, die neu synthetisierte DNA empfängt. Die oben beschriebene einzigartige Stammzelleigenschaft wird genutzt, um brdU-Kennzeichnung enthoben Stammzellen in Primärkulturen durchzuführen und dann ihr Etikett nach BrdU-Waschung nach dem Transfer in die 3D-ankerfreie Sphäroidkultur nachzuverfolgen. Während die Mehrheit der primären Prostataepithelzellen einen basalen und transitverstärkenden Phänotyp in der 2D-Kultur behält, gibt es auch eine seltene Population von multipotenten Stammzellen, die die epitheliale Homöostase auffüllen und aufrechterhalten, wie die Bildung von Sphäroiden oder vollständig differenzierten Organoiden mit entsprechenden Kulturmedien beim Transfer auf 3D-Systeme3,12belegt. In unserem aktuellen Protokoll identifizieren wir durch die Verwendung von HPrEC Prostatasphäroiden oder prostasphärenbasierten BrdU-, CFSE- oder Far Red Retentionstests, gefolgt von fluoreszaktivierter Zellsortierung (FACS), etikettenhaltende Stammzellen in Sphäroiden auf einer Einzelzellebene13.
Wichtig ist, dass wir die Stammzelleigenschaften von etikettenerhaltenden Zellen in frühen Sphäroiden im Vergleich zu den Vorläuferzellen mit Lineage-Verpflichtung weiter bestätigt haben. Dazu gehören Stammzell asymmetrische Teilung, In-vitro-Sphäroid-Bildungsfähigkeit und In-vivo-Geweberegenerationsfähigkeit, erhöhte Autophagie-Aktivität, augmentierte Ribosome-Biogenese und verminderte metabolische Aktivität. Anschließend wurde die RNAseq-Analyse durchgeführt. Es wurden differenziell exprimierte Gene in etikettenerhaltenden Sphäroidzellen beobachtet, die als neuartige Biomarker für menschliche Prostatastammzellen dienen können. Dieser sphäroidbasierte Label-Retaining-Ansatz kann auf Krebsproben angewendet werden, um eine kleine Anzahl von krebsstammähnlichen Zellen zu identifizieren, wodurch translationale Möglichkeiten zur Verwaltung der therapeutischen resistenten Populationen13. Im Folgenden wird der prostasphärenbasierte Labelretentionstest am Beispiel menschlicher Primärprostataepithelzellen (HPrEC) vorgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

Trotz der Fortschritte in der adulten Stammzellforschung bleibt die Identifizierung und Isolierung von Stammzellen aus Gewebeproben eine große Herausforderung. Während ansässige Stammzellen mit Nischenbeschränkungen in erwachsenen Geweben relativ still sind, treten sie in einer ankerfreien dreidimensionalen (3D) Kultur in den Zellzyklus ein und durchlaufen sowohl eine symmetrische als auch eine asymmetrische Zellteilung, was sowohl Stamm als auch Vorläufer Zellen. Letztere vermehren sich schnell und sind die Hauptzellpopulation in verschiedenen Stadien der Abstammungsbindung, die heterogene Sphäroide bilden. Unter Verwendung der primären normalen menschlichen Prostataepithelzellen (HPrEC) wurde ein sphäroidbasierter, etikettenretentionsbezogener Assay entwickelt, der die Identifizierung und funktionelle Isolierung der sphäroid-initiierenden Stammzellen bei einer einzelzelligen Auflösung ermöglicht.
HPrEC oder Zelllinien werden mit BrdU für 10 Tage zweidimensional (2D) kultiviert, um ihre Aufnahme in die DNA aller teilenden Zellen, einschließlich selbsterneuernder Stammzellen, zu ermöglichen. Das Auswaschen beginnt mit der Übertragung in die 3D-Kultur für 5 Tage, in denen sich Stammzellen durch asymmetrische Teilung selbst erneuern und die Sphäroidbildung initiieren. Während relativ stille Tochterstammzellen BrdU-markierte Eltern-DNA behalten, vermehren sich die Tochtervorläufer schnell und verlieren das BrdU-Label. BrdU kann durch CFSE- oder Far Red Pro-Dyes ersetzt werden, die eine livee Stammzellisolierung durch FACS ermöglichen. Die Merkmale der Stammzellwerden werden durch in vitro sphäroide Bildung, In-vivo-Geweberegenerationstests und durch Dokumentation ihrer symmetrischen/asymmetrischen Zellteilungen bestätigt. Die isolierten, etikettenerhaltenden Stammzellen können durch nachgeschaltete molekulare und biologische Studien, einschließlich RNA-seq, ChIP-seq, Einzelzellerfassung, Metabolische Aktivität, Proteomprofilierung, Immunzytochemie, Organoidbildung und In-vivo-Geweberegeneration, streng abgefragt werden. Wichtig ist, dass dieser markerfreie funktionelle Stammzellisolationsansatz stammähnliche Zellen aus frischen Krebsproben und Krebszelllinien aus mehreren Organen identifiziert, was auf eine breite Anwendbarkeit hindeutet. Es kann verwendet werden, um Krebsstamm-ähnliche Zell-Biomarker zu identifizieren, Sieb-Arzneimittel, die auf Krebsstammzellen-ähnliche Zellen abzielen, und neue therapeutische Ziele bei Krebs zu entdecken.

Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen werden in fibronectinbeschichtete Kulturgerichte gelegt und das Zellwachstum wird in der 2D-Kultur beibehalten (Abbildung 1a). Beim Transfer in die 3D-Kultur mit einer Kellermembranmatrix sterben differenzierte Epithelzellen langsam aus. Nur Prostatastammzellen können in einer ankerfreien Kultur überleben und in 5 Tagen Sphäroide bilden (Abbildung 1b).
<p class="jove_cont...

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Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Unter Verwendung menschlicher primärer Prostataepithelzellen berichten wir über eine neuartige biomarkerfreie Methode der funktionellen Charakterisierung von stammähnlichen Zellen durch einen sphäroidbasierten Labelretentionstest. Für die Beschriftung von BrdU-, CFSE- oder Far Red 2D-Zellen wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll beschrieben. dreidimensionale Sphäroidbildung; kennzeichnungserhaltende stammähnliche Zellidentifikation durch Immunzytochemie; isolierung durch FACS.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Die Stammzellisolation bleibt eine große Herausforderung durch die Ko-Isolation von Vorläuferzellen mit aktuellen Methoden. Wir haben einen neuartigen biomarkerfreien Assay entwickelt, um ruhende Stammzellen von gemischten Vorläufern zu isolieren. Der Hauptvorteil dieses sphäroidbasierten, Etikettenretentions-Assays, es kann lebende Stammzellen von ihren Tochtervorläufern durch FACS mit CFSE- oder Far Red-Etikettierung erweitern und isolieren.Während konventionelle Therapien die meisten Prostatakrebszellen ausrotten, bleiben Krebsstammzellen aufgrund therapeutischer Resistenz enden, was das Fortschreiten der Krankheit antreibt. Die stammartige Zellisolierung ermöglicht die Identifizierung neuartiger Gene, die therapeutisch für eine wirksame Krankheitsremission mitgezielt werden können. Unser Label-Retention-Assay ist für die normale Stammzellisolierung aus verschiedenen Geweben und Zellen sowie für die Krebsstammzellforschung geeignet.Wichtig ist, dass dieser Assay auf andere Epithelzellkrebsarten wie Brust- und Dickdarmkrebs anwendbar ist. Beginnen Sie mit der Beschichtung von 100-Millimeter-Kulturgerichten mit zwei Millilitern 2,5-Mikrogramm-Fibronectin-Lösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Dann die Lösung ansaugen und die Kulturgerichte 45 Minuten lang im Biosicherheitsschrank trocknen lassen.Fügen Sie neun Milliliter des Prostataepithelzellwachstumsmediums zu einer fibronectinbeschichteten Schale hinzu und halten Sie es im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius warm. Eine Durchstechflasche mit gefrorenen menschlichen Prostataepithelzellen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auftauen und die Zellen in 10 Milliliter warmem Medium wieder aufhängen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 mal g für fünf Minuten.Dann den Überstand ansaugen und entsorgen. Die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium aussetzen und einen Milliliter der Suspension direkt auf die fibronectinbeschichtete Schale mit dem vorgewärmten Medium übertragen. Dann inkubieren Sie die Schale im Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Wenn Sie die Zellen mitbeschriften, bereiten Sie BrdU-markierte Zellen in einer 10-Tage-2D-Kultur vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Dann fügen Sie fünf Mikromolar CFSE oder Far Red und inkubieren die Zellen für 30 Minuten. Nach der Inkubation das Medium vorsichtig mit dem Farbstoff ansaugen und die Zellen zweimal mit fünf Millilitern warmen PBS waschen.Als nächstes führen Sie die enzymatische Verdauung mit 05%trypsin EDTA gemäß den Manuskriptrichtungen durch. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Die Zellen wurden in eiskalter, eins-zu-eins-Kellermembranmatrix und Kulturmedium-Mix für 3D-Prostasphärenbildung resuspendiert.Um die Prostasphärenkultur in einem 3D-Kellermatrixsystem vorzubereiten, tauen Sie die Kellermembranmatrix über Nacht bei vier Grad Celsius auf und halten Sie sie vor dem Gebrauch auf Eis. Dann sanft einen Milliliter eiskalte Kellermembranmatrix in ein gleiches Volumen eiskaltes Kulturmedium geben. Pipette nach oben und unten zu mischen, darauf achten, keine Luftblasen einzuführen.Resuspend fünfmal 10 bis 1/4 menschliche Prostata-Epithelzellen in eiskalten Eins-zu-eins-Kellermembranmatrix und Kulturmedien mischen für ein Gesamtvolumen von 500 Mikroliter. Pipette die Lösung auf den unteren Rand jedes Brunnens und wirbeln Sie die Platte gleichmäßig verteilen die Mischung. Legen Sie die Platte 30 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius Kohlendioxid-Inkubator, damit sich die Matrix erstarren kann.Dann bedecken Sie es mit einem Milliliter warme Kultur Medium pro Brunnen, um sicherzustellen, dass der Ring nicht stören. Um die CFSE-gekennzeichneten Prostasphären zu ernten, ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter Dispase und Pipetten nach oben und unten, um es mehrmals zu mischen. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Matrix zu verdauen, und sammeln Sie das Kugelgemisch dann in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr.Zentrifugieren Sie die Kugeln fünf Minuten lang mit 500 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Das Pellet in 500 Mikroliter warmem 05%trypsin EDTA wieder aufhängen und in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr geben. Inkubieren Sie die Kugeln bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten, dann fügen Sie 500 Mikroliter warme PBS mit 10%FBS.Führen Sie sie durch eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26-Spur-Nadel, um die Kugeln vollständig zu trennen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500-fachm g. Dann den Überstand ansaugen und entsorgen.Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium mit einem Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid aus, um die abgestorbenen Zellen zu färben und eine Minute bei Raumtemperatur zu bebrüten. Wiederholen Sie die Zentrifugation, und entsorgen Sie den Überstand. Dann waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter warmes Medium.Wiederholen Sie die Zentrifugation, und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter warmen Kulturmedium aus und sammeln Sie die Zellen in fünf Milliliter Polystyrol runden Bodenröhrchen, indem Sie sie durch 35-Mikron Porengröße Zellsieb Fangkappen filtern. Führen Sie eine FACS-Analyse von trypsindisperdiszierten CFSE-markierten Prostasphärenzellen durch.Verwenden Sie nicht-markierte Zellen als Negative-Control und CFSE-markierte Zellen als positivmarkierte Steuerung, um die Gates festzulegen, führen Sie die Probe aus, um die Subpopulationen von fraktionierten CFSE-hohen und CFSE-niedrigen Zellen zu sortieren und zu sammeln. Primäre normale menschliche Prostataepithelzellen wurden in fibronectin-beschichtete Kulturgerichte gelegt und das Zellwachstum wurde in der 2D-Kultur beibehalten. Beim Transfer in eine 3D-Kultur mit einer Kellermembranmatrix starben differenzierte Epithelzellen langsam aus und nur Prostatastammzellen blieben übrig.Die Dual-Labeling von Prostata-Epithelzellen in der 2D-Kultur gefolgt von Sphäroidbildung in der 3D-Kultur zeigte die Kolokalisierung von BrdU, CFSE und Far Red in den gleichen etikettenerhaltenden Zellen. Duale Immunfärbung zeigte, dass etikettenerhaltende Zellen einen niedrigeren Gehalt an Cytokeratin-Protein Keratin 14, ein vermindertes Zellknotenprotein E-Cadherin, erhöhte Stammzell-Frühmarkerproteine Wnt10b und ALDH1A1, erhöhtes Autophagieprotein LC3 und erhöhtes Myosin-IIB aufweisen. Darüber hinaus erkennt der sphäroidbasierte, etikettenretentionsbasierte Assay erfolgreich krebsstammartige Zellen in Prostatakrebsproben.CFSE-markierte, haltmähnliche Krebszellen und Sphäroide, die aus menschlichen Prostatakrebsproben gewonnen wurden, zeigten ein reduziertes E-Cadherin-Protein im Vergleich zu den nicht gekennzeichneten Vorläuferzellen. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, die Matrix in flüssiger Form für die Vorbereitung des Kulturmediums beizubehalten. Lagern Sie es über Nacht bei vier Grad, und kühlen Sie Pipettenspitzen in eiskaltem PBS vor der Dosiermatrix.Nach der Isolierung von Stammzellen mit dem sphäroidbasierten Labelretentionstest können einzellige RNA-Sequenzierungen und proteomische Analysen durchgeführt werden, um spezifische Gene und neuartige Biomarker in Stammzellen zu identifizieren. Die Isolierung lebender Krebsstammzellen durch den sphäroidbasierten Labelretentionstest ermöglicht es Forschern, krebsstammzellabgeleitete Tumoroide in vitro zu züchten und neuartige Krebsmedikamente zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Gründung der Krebszellkulturen von Human Konventionelle Osteosarkom Stem

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Forschung

Krebsforschung

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

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Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

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Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

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Entdeckung von Treiber-Genen in kolorektalen HT29-abgeleiteten Krebs-Stamm-ähnlichen Tumorsphären

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Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluierung des Zelltods mit zellfreiem Überstand von Probiotika in dreidimensionalen sphäroiden Kulturen von Darmkrebszellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...