Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

מחקר זה היה נתמך על ידי מענקים מן המכון הלאומי לסרטן R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). אנו מודים לליבת הזרימה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו לסיוע במיון תאים.

כל הטיפול בתאים וההכנות מדיה יש לבצע בטכניקת אספטי בקבינט בטיחות ביולוגית Class II (תואר ראשון).
1. תרבות ואחזקה של תאים HPrEC ב-2D
<ol><li>המעיל 100 מ"מ מנות תרבות עם 2 מ ל של 2.5 μg/ס"מ2 fibronectin פתרון לילה בטמפרטורת החדר (RT). מייבשים את התמיסה ומאפשרים לתרבות להתייבש באוויר בתואר ראשון ל4...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

הזרמת cy, לנסות באמצעות מספר סמנים פני השטח גזע היא גישה נפוץ עבור מחקר תאי גזע למרות המחסור הן ספציפיות ובסלקטיביות1,5,6. בעוד היווצרות ספרואיד במערכת תרבות תלת-ממד היא עוד שיטה שימושית בהעשרת האוכלוסיה הנדירה של תאי גזע מתאי האפיתל העיקרי?...

בלוטת הערמונית האנושית מכיל אפיתל הלומינום עם תפקוד הפרשה ותאי בסיס המשמשים אותו יחד עם רכיב חריג מנוירואנדוקריניים תאים. התאים האפיתל, במקרה זה, נוצרות מאוכלוסיה נדירה של תאי גזע הערמונית כי הם השקט יחסית vivo ולפעול כמערכת תיקון כדי לשמור על הומאוסטזיס בלוטות ברחבי החיים1. למרות מספר מקדמות, הבידוד ההזדהות והפונקציונלי של תאי גזע הערמונית נשאר אתגר גדול בתחום. תא גזע ביואריטים, כולל מתודולוגיות מבוססות סמן תא מבוסס בשילוב עם הזרמת cy, משמשים בדרך כלל עבור מחקר תאי גזע2,3,4. עם זאת, תוצאות עבור העשרה ובידוד להשתנות באופן נרחב כפונקציה של שילובים סמן ונוגדן ספציפיות5,6, העלאת שאלות על זהותו של התאים המבודדים. גישה נוספת בשימוש נרחב עבור העשרה תאים גזע דמוי הוא תלת מימדי (3d) תרבות ספרואיד2,3,4. בעוד תאי גזע תושב הם השקט יחסית ב vivo עם מרסנים נישה, הם עוברים חלוקת התא בתרבות מטריקס תלת-ממד (הן סימטרי ו-אסימטרי), יצירת תאים גזע ומחולל קדמון במהירות להתרבות לכיוון שושלת היוחסין7,8. הרורואידים שנוצרו הם תערובת הטרוגנית המכילה תאי גזע ותאים מחולל שלבים בשלבים שונים של מחויבות השושלת, כולל מוקדם ומאוחר תאים בשלב הקדמון. כך, בחני אומר שימוש בspheroids כולו אינם תא גזע בלעדי, מה שהופך את הזיהוי של מאפייני תא גזע ייחודי לא חד-משמעית. לכן, זה קריטי ליצור בחני לזהות ולהפריד תאים גזע הערמונית ושלתי בתם. לקראת סוף זה, המטרה של הפרוטוקול הנוכחי היא להקים מערכת שיטה המאפשרת זיהוי יעיל ובידוד של תאי גזע מרקמות הערמונית האנושית ואחריו בדיקה חזקה במורד הזרם של התפקודים הביולוגיים שלהם.
לטווח ארוך 5-bromo-2'-deoxyuridine (bromo) תווית-שימור משמש רבות עבור vivo ובמעקב השושלת מבחנה של תאי גזע מבוסס על זמן ההכפלה הממושך שלהם9,10. הגישה הנוכחית לזיהוי תא גזע הערמונית ובידוד המתואר בזאת מבוססת על המאפיין השקט היחסי שלהם והחזקת תוויות בתוך אוכלוסיית אפיתל מעורבת. יתר על כן, מבוסס על השערת ה-DNA גדיל הנצחי, רק תאי גזע יכולים לעבור חלוקת תאים אסימטריים. תא הגזע מייצג את התא הבת המכיל את ה-DNA הורים מבוגרים בעוד התא מחולל, שהוא תא הבת מחויבת, מקבל את ה-DNA החדש מסונתז. המאפיין תא גזע ייחודי המתואר לעיל הוא ניצל כדי לבצע תיוג BrdU בתאי גזע הורים בתרבויות הראשיות ולאחר מכן לעקוב אחר התווית שלהם בעקבות BrdU-כשלון בעת העברת 3D עוגן-התרבות ספרואיד ללא. בעוד שרוב התאים העיקריים האפיתל הערמונית לשמור על בסיס ומעבר הגברה פנוטיפ בתרבות 2d, יש גם אוכלוסייה נדירה של תאים גזע רב עוצמה מחידוש ושמירה על הומאוסטזיס אפיתל כפי שמעידים על ידי היווצרות spheroidsאו באופןמלא אורגנואידים עם מדיה התרבות המתאימהעם העברתמערכות 3d3 בפרוטוקול הנוכחי שלנו, באמצעות הערמונית hprec באמצעות spheroids או prostasphere מבוסס brdu, cfse, או שמירה האדום הרחוק בחני מיון הופעל על ידי האתר הפעיל פלואורסצנטית (facs), אנו מזהים בתאי גזע שמירת תוויות ב spheroids ברמת תא בודד13.
חשוב לעשות זאת, אנו מאשרים את תאי הגזע של תאים התומכים בתוויות בתוך השלב המוקדם בהשוואה לתאי הקדמון עם מחויבות השושלת. אלה כוללים החלוקה האסימטרית של תא גזע, ביכולת היווצרות מחוץ לתחום העור ובקיבולת התחדשות vivo רקמות, פעילות אוטומטית מוגבר, הריבובביוגנזה מורחבת וירידה בפעילות מטבולית. לאחר מכן, ניתוח RNAseq בוצע. דיפרנציאלי הביע גנים בתאים ספרואיד שמירת תוויות נצפו כי עשוי לשמש בסמנים הרומן עבור תאים גזע האדם הערמונית. זו הגישה מבוססי תווית שמירה על תוויות יכול לחול על דגימות סרטן כדי לזהות באופן דומה מספר קטן של תאים גזע דמוי סרטן, ובכך מספק הזדמנויות translational לנהל את אוכלוסיות עמידות טיפולית13. המוצג להלן הוא prostasphere מבוססי תווית שמירה שיטת השמירה באמצעות תאים האפיתל הערמונית העיקרי האנושי (HPrEC) כדוגמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

למרות ההתקדמות במחקר תאי גזע מבוגרים, זיהוי ובידוד של תאי גזע מדגימות רקמה נשאר אתגר גדול. בעוד תאי גזע תושב הם השקט יחסית עם מרסנים נישה ברקמות מבוגרים, הם נכנסים למחזור התא בתרבות תלת-מימדית תלת ממדית (3D) ולעבור שתי החלוקה התא סימטרי ו אסימטרית, המעניקה הן גזע ומחולל קדמון תאים. האחרון מתרבים במהירות, הם אוכלוסיית התאים העיקריים בשלבים שונים של מחויבות השושלת, היוצרים spheroids הטרוגנית. באמצעות העיקרי האנושי נורמלי האפיתל הערמונית תאים (HPrEC), מבוסס ספרואיד, שמירה על התווית שיטת השמירה פותחה כי מאפשר זיהוי ובידוד פונקציונלי של תאי גזע ספרואיד ליזום ברזולוציה תא יחיד.
HPrEC או קווי התאים הם דו מימדי (2D) תרבותי עם BrdU 10 ימים כדי לאפשר התאגדות שלה ל-DNA של כל התאים המפריד, כולל תאי גזע לחידוש עצמי. לשטוף את מתחיל עם העברה לתרבות תלת-ממד עבור 5 ימים, במהלכה תאי גזע להתחדש באמצעות חלוקה אסימטרית וליזום היווצרות ספרואיד. בעוד השקט יחסית בתאי גזע בת לשמור BrdU התווית DNA הורים, הבת ושלתי מתרבים במהירות, לאבד את תווית BrdU. BrdU יכול להיות החליף עם CFSE או בצבע אדום הפרו-צבעים, אשר להתיר בידוד תא גזע חי על ידי FACS. מאפייני תא גזע מאושרים על ידי היווצרות מחוץ למבחנה, בvivo רקמות התחדשות הרקמה, ועל ידי תיעוד חטיבות התאים סימטרי/אסימטרי שלהם. בודדים מותג תוויות בתאי גזע ניתן לחקור בקפדנות על ידי במורד לימודים מולקולריים הביולוגיים, כולל RNA-seq, שבב-seq, לכידת תא בודד, פעילות מטבולית, פרופיל פרוטדום, אימונולוציטוכימיה, היווצרות אורגאיד, והתחדשות רקמות vivo. חשוב לציין, זה מסמן הגישה חופשי גזע פונקציונלי בידוד מזהה תאים גזע כמו מדגימות סרטן טריים ושורות תאים סרטניים מאיברים מרובים, מציע ישימות רחב. זה יכול לשמש כדי לזהות את הסרטן כמו גזע תאים ביוארקרס, תרופות המסך מיקוד סרטן כמו תאים, ולגלות מטרות טיפוליות הרומן סרטן.

בתאי אפיתל הערמונית האנושי העיקרי ממוקמים לתוך מנות התרבות מצופה fibronectin וצמיחת תאים נשמרת בתרבות דו-ממדית (איור 1א). עם העברת לתוך תרבות תלת-ממד עם מטריצה קרום המרתף, הבדיל תאים אפיתל למות לאט החוצה. רק תאים גזע הערמונית יכולים לשרוד בתרבות ללא עוגן ו-spheroids טופס ב 5 י?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

שימוש בתאי אפיתל הערמונית העיקרי האנושי, אנו מדווחים על שיטה ביוארינקר הרומן החופשי של אפיון פונקציונלי של תאים גזע דמוי על ידי שמירת תווית מבוסס ספרואיד מבוססי. פרוטוקול צעד אחר צעד מתואר עבור BrdU, CFSE, או הרחוק האדום תיוג תא 2D; היווצרות ספרואיד תלת מימדי; זיהוי תאים מתמך בתוויות באמצעות כימיה חיסונית מדומה; ובידוד על ידי FACS.

בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

בידוד תאי גזע נותר אתגר גדול עקב בידוד שותף של תאים סניטריים בשיטות הנוכחיות. פיתחנו סמן ביולוגי חדשני כדי לבודד תאי גזע הרה-חיים של תווי עורב מעורבים. היתרון העיקרי של זה מבוסס כדורית, שמירה על תווית assay, זה יכול להרחיב ולבודד תאי גזע חיים מן אביהם בתם על ידי FACS באמצעות CFSE או תיוג אדום רחוק.בעוד טיפולים קונבנציונליים לחסל את רוב התאים סרטן הערמונית, תאי גזע סרטניים להישאר בשל התנגדות טיפולית, ובכך מניעים את התקדמות המחלה. בידוד תאים דמוי גזע יאפשר זיהוי של גנים חדשניים שיכולים להיות ממוקדים טיפולית להפוגת מחלות יעילה. ההחזקה שלנו ישימה לבידוד תאי גזע תקינים מרקמות ותאים שונים, ולחקר תאי גזע סרטניים.חשוב לציין, זה assay של ישים סרטן תאי אפיתל אחרים, כגון סרטן השד וסרטן המעי הגס. התחל על ידי ציפוי 100 מילימטר מנות תרבות עם שני מיליליטר של 2.5 פתרון פיברונקטין מיקרוגרם דגירה אותם לילה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שאף את הפתרון ותן לצלחות התרבות להתייבש בארון הביו-בטיחות במשך 45 דקות.מוסיפים תשעה מיליליטר של תא אפיתל הערמונית צמיחה בינונית לצלחת מצופה פיברונקטין ולשמור אותו חם באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. להפשיר בקבוקון אחד של תאי אפיתל ערמונית אנושיים קפואים באמבט מים צלזיוס 37 מעלות, ו resuspend התאים ב 10 מיליליטר של מדיום חם. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 500 פעמים g במשך חמש דקות.ואז שאף והשליך את העל-טבעי. תן את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות חם ולהעביר מיליליטר אחד של ההשעיה ישירות לצלחת מצופה fibronectin עם המדיום מחומם מראש. ואז להחגירה את המנה באינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.אם אתם מתייגים במשותף את התאים, הכינו תאים המסווים ב- BrdU בתרבות דו-מימדית של 10 ימים כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן להוסיף חמישה CFSE מיקרומולרי או אדום רחוק דגירה התאים במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, בזהירות לשאוב את המדיום עם הצבע ולשטוף את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS חם.לאחר מכן, לבצע עיכול אנזימטי עם 05% טריפסין EDTA על פי הוראות כתב היד. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. התאים היו מתווסתים במטריצת קרום מרתף קרה כקרח, מטריצת קרום מרתף אחד לאחד ותערובת בינונית תרבותית להיווצרות פרוסטספירה תלת-מימדית.כדי להכין את תרבות הפרוסטספרה במערכת מטריצת מרתף תלת מימדית, הפשיר את מטריצת קרום המרתף בארבע מעלות צלזיוס בן לילה ולשמור אותה על קרח לפני השימוש. לאחר מכן הוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף קרה כקרח לנפח שווה של מדיום תרבות קר כקרח. פיפטה למעלה ולמטה לערבב, דואג לא להציג בועות אוויר.יש להזרים חמש פעמים 10 עד 1/4 תאי אפיתל של הערמונית האנושית במטריצת קרום מרתף קרה כקרח של אחד לאחד ותערובת מדיה תרבותית לנפח כולל של 500 מיקרוליטרים. פיפטה הפתרון לקצה התחתון של כל באר לערבב את הצלחת כדי להפיץ את התערובת באופן שווה. מניחים את הצלחת באינקובטור פחמן דו חמצני 37 מעלות במשך 30 דקות כדי לאפשר למטריצה להתגבש.ואז לכסות אותו עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות חמה לגם, הקפד לא להפריע לטבעת. כדי לקצור את prostaspheres שכותרתו CFSE להחליף את המדיום עם שני מיליליטר dispapase ו pipette למעלה ולמטה לערבב מספר פעמים. להחגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לעכל את המטריצה, ולאחר מכן לאסוף את תערובת הכדור לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.צנטריפוגה הכדורים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant. תבזבזו מחדש את גלולת הכדור ב-500 מיקרוליטרים של EDTA חם של 05% טריפסין, והעברו אותם לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הדגירה את הכדורים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להוסיף 500 microliters של PBS חם עם 10% FBS.מעבירים אותם דרך מזרק של מיליליטר אחד עם מחט של 26 מד כדי לנטרל לחלוטין את הספירות. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. ואז שאף והשליך את העל-טבעי.תן שימוש חוזר בתאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות חם עם מיקרוגרם אחד לכל יודיד פרופידיום מיליליטר כדי להכתים את התאים המתים לדגר אותם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. חזור על הצנטריפוגה, והשליך את העל-טבעי. ואז לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של מדיום חם.חזור על הצנטריפוגה, והשליך את העל-טבעי. תן שוב את התאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות חם ולאסוף את התאים בצינורות תחתונים עגולים פוליסטירן חמישה מיליליטר על ידי סינון אותם דרך 35 מיקרון גודל צינורות התא מסננת הצמד. בצע ניתוח FACS של תאי פרוסטספירה עם תווית CFSE המפוזרים על-ידי טריפסין.באמצעות תאים שאינם מסומנים בתווית שלילית ותאים המסומנו בתווית CFSE כפקד חיובי כדי להגדיר את השערים, הפעל את המדגם כדי למיין ולאסוף את תת-התיאום של תאים מופרדים בגובה CFSE ו- CFSE-low. תאי אפיתל הערמונית האנושיים הנורמליים העיקריים הוכנסו לתוך מנות תרבות מצופות פיברונאטין וצמיחת תאים נשמרה בתרבות 2D. עם ההעברה לתרבות תלת מימדית עם מטריצת קרום מרתף, תאי אפיתל מובחנים מתו לאט לאט ורק תאי גזע הערמונית נשארו.תיוג כפול של תאי אפיתל הערמונית בתרבות דו-מימדית ואחריו היווצרות כדורית בתרבות תלת-מימדית הראו קולוקליזציה של BrdU, CFSE ו- Far Red באותם תאים השומרים על תווית. immunostaining כפול הראה כי תאים שומרי תווית להפגין רמות נמוכות יותר של קרטין חלבון cytokeratin 14, חלבון צומת התא ירד E-cadherin, תאי גזע מוגברת חלבונים סמן מוקדם Wnt10b ו ALDH1A1, חלבון אוטופגיה מוגברת LC3, ו IIB מיוסין מוגברת. יתר על כן, spheroid מבוסס, תווית שמירה assay בהצלחה מזהה תאים דמויי גזע סרטן בדגימות סרטן הערמונית.CFSE שכותרתו שמירה על תאים סרטניים דמויי גזע וספירואידים שמקורם דגימות סרטן הערמונית האנושי הציג חלבון E-cadherin מופחת ביחס לתאי האחווה שאינם מסומנים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לשמור על מטריצה בצורה נוזלית להכנת תרבות בינונית. אחסנו אותו במשך הלילה בארבע מעלות, וצננים טיפים ב-PBS קר כקרח לפני חלוקת מטריצה.לאחר בידוד של תאי גזע באמצעות מבדיקת שימור תוויות המבוססת על כדורית, ניתן לבצע רצף RNA חד-תאי וניתוח פרוטומי כדי לזהות גנים ספציפיים וסמנים ביולוגיים חדשניים בתאי גזע. בידוד של תאי גזע סרטניים חיים על ידי הראיה המבוססת על תווית spheroid מאפשר לחוקרים לגדל גידולים שמקורם בתאי גזע סרטניים במבחנה ולהסקרן תרופות חדשניות נגד סרטן.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

הקמת סרטן גזע תא תרבויות מן האדם הקונבנציונלי אוסטאוסרקומה

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

בידוד של תאי אנדותל אדם נורמלי המעי הגס, סרטן המעי הגס - פרוטוקול משופר

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

מחקה וטיפול מטפלזיה Acinar-כדי-Ductal הלבלב בתרבות תלת-ממדי תא

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

גילוי של גנים הנהג ב המעי הגס HT29-נגזר סרטן גזע כמו Tumorspheres

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...