Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Ringraziamo il Flow Cytometry Core dell'Università dell'Illinois a Chicago per l'assistenza sullo smistamento delle cellule.

Tutte le manipolazioni delle cellule e i preparati dei supporti devono essere eseguiti con tecnica asettica in un mobile di sicurezza biologica di classe II (BSC).
1. Cultura e manutenzione delle cellule HPrEC in 2D
<ol><li>Cappotto 100 mm piatti di coltura con 2 mL di 2,5 g / cm2 soluzione fibronectina durante la notte a temperatura ambiente (RT). Aspirare la soluzione e lasciare asciugare i piatti della coltura nel BSC per 45 min.</li>
	<li>Aggiungere 9 mL del mezzo di crescita ...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

La citometria di flusso con più marcatori di superficie di cellule staminali è un approccio comunemente usato per la ricerca sulle cellule staminali, nonostante manchi sia di specificità che di selettività1,5,6. Mentre la formazione di sferoidi in un sistema di coltura 3D è un altro metodo utile per arricchire la popolazione di cellule staminali rare da cellule epiteliali primarie, tra cui HPrEC, gli sferoidi risultanti son...

La ghiandola prostatica umana contiene epitelio luminoso con funzione secretoria e cellule basali sottostanti insieme a un insolito componente delle cellule neuroendocrine. Le cellule epiteliali, in questo caso, sono generate da una rara popolazione di cellule staminali prostate che sono relativamente quiescenti in vivo e fungono da sistema di riparazione per mantenere l'omeostasi ghiandolare per tutta la vita1. Nonostante molti progressi, l'identificazione e l'isolamento funzionale delle cellule staminali prostata rimane una sfida importante nel settore. I biomarcatori delle cellule staminali staminali, comprese le metodologie basate su marcatori di superficie cellulare combinate con la citometria di flusso, sono comunemente utilizzati per la ricerca sulle cellule staminali2,3,4. Tuttavia, i risultati per l'arricchimento e l'isolamento variano ampiamente in funzione delle combinazioni di marcatori e della specificità degli anticorpi5,6, sollevando domande sull'identità delle cellule isolate. Un altro approccio ampiamente utilizzato per l'arricchimento delle cellule staminali è la coltura tridimensionale (3D) degli sferoidi2,3,4. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti in vivo con vincoli di nicchia, subiscono la divisione cellulare nella coltura a matrice 3D (sia simmetrica che asimmetrica), generando cellule staminali e progenitrici che si riproducono rapidamente verso l'impegno di lignaggio7,8. Gli sferoidi formati sono una miscela eterogenea contenente sia cellule staminali che cellule progenitrici in varie fasi dell'impegno di lignaggio, comprese le cellule progenitrici in fase iniziale e tardiva. Pertanto, i saggi che utilizzano gli interi sferoidi non sono esclusivi per le cellule staminali, rendendo inconcludente l'identificazione di proprietà uniche delle cellule staminali. Pertanto, è fondamentale creare saggi per identificare e separare le cellule staminali della prostata dai loro progenitori figlia. A tal fine, l'obiettivo dell'attuale protocollo è quello di stabilire un sistema di analisi che consenta l'identificazione e l'isolamento efficienti delle cellule staminali dai tessuti prostata umani seguiti da una solida analisi a valle delle loro funzioni biologiche.
La ritenzione a lungo termine dell'etichetta a 5-bromo-2'-deoxyuridina (BrdU) è ampiamente utilizzata per la tracciabilità in vivo e in vitro delle cellule staminali in base al loro tempo di raddoppio prolungato9,10. L'attuale approccio per l'identificazione delle cellule staminali prostate e l'isolamento descritto qui si basa sulle loro caratteristiche quiescenti relative e sulle proprietà di ritenzione delle etichette all'interno di una popolazione epiteliale mista. Inoltre, sulla base dell'ipotesi del DNA del filamento immortale, solo le cellule staminali possono subire la divisione asimmetrica delle cellule. La cellula staminale rappresenta la cellula figlia che contiene il DNA parentale più vecchio, mentre la cellula progenitore, che è una cellula figlia impegnata, riceve il DNA appena sintetizzato. L'esclusiva proprietà delle cellule staminali descritta in precedenza viene sfruttata per eseguire l'etichettatura BrdU nelle cellule staminali parentali nelle colture primarie e quindi tenere traccia della loro etichetta dopo il lavaggio di BrdU al momento del trasferimento nella coltura di sferidi senza ancoraggio 3D. Mentre la maggior parte delle cellule epiteliali prostate primarie conservaun fenotipo basale e di transito amplificando nella coltura 2D, c'è anche una rara popolazione di cellule staminali multipotenti che ricostituiscono e mantengono l'omeostasi epiteliale come evidenziato dalla formazione di sferoidi o organoidi completamente differenziati con corrispondenti mezzi di coltura al momento del trasferimentoaisistemi 3D3,12. Nel nostro protocollo attuale, utilizzando sferoidi prostata HPrEC o brdU, CFSE o far Red ritenzioni seguite dallo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), identifichiamo cellule staminali che conservano l'etichetta negli sferoidi a livello di singola cellula13.
È importante sottolineare che abbiamo ulteriormente confermato le caratteristiche delle cellule staminali delle cellule che conservano l'etichetta all'interno di sferoidi in fase iniziale rispetto alle cellule progenitrici con impegno di lignaggio. Questi includono la divisione asimmetrica delle cellule staminali, la capacità di formazione di sferoidi in vitro e la capacità di rigenerazione dei tessuti in vivo, elevata attività dell'autofagia, biogenesi ribosomiana aumentata e diminuzione dell'attività metabolica. Successivamente, è stata eseguita l'analisi RNAseq. Sono stati osservati geni espressi in modo differenziale nelle cellule sferoidi che conservano l'etichetta che possono servire come nuovi biomarcatori per le cellule staminali della prostata umana. Questo approccio basato su sferoidi, che mantiene l'etichetta può applicarsi ai campioni di cancro per identificare in modo simile un piccolo numero di cellule staminali tumorali, fornendo così opportunità traslazionali per gestire le popolazioni resistenti terapeutiche13. Di seguito è presentato il saggio di ritenzione delle etichette basato sulla prostasfera che utilizza come esempio le cellule epiteliali primarie umane (HPrEC).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

Nonostante i progressi nella ricerca sulle cellule staminali adulte, l'identificazione e l'isolamento delle cellule staminali dai campioni di tessuto rimane una sfida importante. Mentre le cellule staminali residenti sono relativamente quiescenti con vincoli di nicchia nei tessuti adulti, entrano nel ciclo cellulare in coltura tridimensionale senza ancora (3D) e subiscono sia la divisione cellulare simmetrica che asimmetrica, dando origine sia al gambo che al progenitore Cellule. Questi ultimi proliferano rapidamente e sono la popolazione cellulare principale in varie fasi dell'impegno di lignaggio, formando sferoidi eterogenei. Utilizzando le normali cellule epiteliali della prostata umana primaria (HPrEC), è stato sviluppato un saggio basato su sferoide di ritenzione di etichette che consente l'identificazione e l'isolamento funzionale delle cellule staminali che lo sferoide operino a una risoluzione a singola cellula.
HPrEC o linee cellulari sono bidimensionali (2D) coltivate con BrdU per 10 giorni per consentire la sua incorporazione nel DNA di tutte le cellule che si dividono, comprese le cellule staminali auto-rinnovanti. Wash out inizia al momento del trasferimento alla coltura 3D per 5 giorni, durante i quali le cellule staminali si auto-rinnovano attraverso la divisione asimmetrica e avviano la formazione di sferoidi. Mentre le cellule staminali figlie relativamente quiescenti conservano il DNA parentale etichettato da BrdU, i progenitori della figlia proliferano rapidamente, perdendo l'etichetta BrdU. BrdU può essere sostituito con CFSE o Far Red pro-dyes, che consentono l'isolamento delle cellule staminali vive da FACS. Le caratteristiche delle cellule staminali sono confermate dalla formazione in vitro sferoide, dai saggi di rigenerazione dei tessuti in vivo e dalla documentazione delle loro divisioni cellulari simmetriche/asimmetriche. Le cellule staminali isolate che conservano l'etichetta possono essere rigorosamente interrogate da studi molecolari e biologici a valle, tra cui RNA-seq, ChIP-seq, cattura a singola cellula, attività metabolica, profilazione del proteoma, immunocitochimica, formazione di organiidi e rigenerazione dei tessuti in vivo. È importante sottolineare che questo approccio di isolamento delle cellule staminali funzionali privo di marcatori identifica le cellule staminali provenienti da campioni di cancro freschi e linee cellulari tumorali di più organi, suggerendo un'ampia applicabilità. Può essere usato per identificare biomarcatori cellulari simili a tumori, prodotti farmaceutici di schermata che prendono di mira le cellule staminali tumorali e scoprire nuovi bersagli terapeutici nei tumori.

Le normali cellule epiteliali umane primarie vengono inserite in piatti di coltura rivestiti di fibronectina e la crescita cellulare è mantenuta nellacoltura2D ( Figura 1a). Al momento del trasferimento nella coltura 3D con una matrice di membrana seminterrato, le cellule epiteliali differenziate si esauriscono lentamente. Solo le cellule staminali della prostata possono sopravvivere in una coltura senza ancora e formare sferoidi in 5 giorni (Figura 1</...

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Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Utilizzando le cellule epiteliali primarie umane, riportiamo un nuovo metodo privo di biomarcatori di caratterizzazione funzionale delle cellule staminali da un saggio di ritenzione di etichette basato su sferoidi. Viene descritto un protocollo passo-passo per l'etichettatura delle celle 2D BrdU, CFSE o Far Red; formazione di sferoidi tridimensionali; l'identificazione delle cellule staminali di conservazione dell'etichetta mediante immunocitochimica; e l'isolamento da parte della FACS.

Isolamento di cellule simili a stelo dalle colture speroidi a 3 dimensioni

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

L'isolamento delle cellule staminali rimane una sfida importante a causa del co-isolamento delle cellule progenitrici utilizzando i metodi attuali. Abbiamo sviluppato un nuovo saggio privo di biomarcatori per isolare le cellule staminali quiescenti dai progenitori misti. Il principale vantaggio di questo saggio di ritenzione delle etichette a base di sferoidi, può espandere e isolare le cellule staminali vive dai loro progenitori figli da FACS utilizzando l'etichettatura CFSE o Far Red.Mentre le terapie convenzionali debellano la maggior parte delle cellule tumorali della prostata, le cellule staminali tumorali rimangono dovute alla resistenza terapeutica, guidando così la progressione della malattia. L'isolamento cellulare simile a quello delle staminali consentirà l'identificazione di nuovi geni che possono essere corresponso terapeuticamente per un'efficace remissione delle malattie. Il nostro test di ritenzione di etichette è applicabile per il normale isolamento delle cellule staminali da vari tessuti e cellule e per la ricerca sulle cellule staminali tumorali.È importante sottolineare che questo test è applicabile ad altri tumori delle cellule epiteliali, come i tumori al seno e al colon-retto. Inizia rivestendo piatti di coltura da 100 millimetri con due millilitri di soluzione di fibronecina da 2,5 microgrammi e incubali durante la notte a temperatura ambiente. Quindi aspirare la soluzione e lasciare asciugare all'aria i piatti di coltura nell'armadio della biosicurezza per 45 minuti.Aggiungere nove millilitri del mezzo di crescita delle cellule epiteliali della prostata a un piatto rivestito di fibronectina e tenerlo caldo nell'incubatrice di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Scongelare una fiala di cellule epiteliali prostatiche umane congelate in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e rimescolare le cellule in 10 millilitri di mezzo caldo. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 volte g per cinque minuti.Quindi aspirare e scartare il supernatante. Risosopendare le cellule in un millilitro di mezzo di coltura caldo e trasferire un millilitro della sospensione direttamente al piatto rivestito di fibronectina con il mezzo preri warmed. Quindi incubare il piatto nell'incubatrice di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.Se coeticheggiate le celle, preparate le celle etichettate BrdU in 10 giorni di coltura 2D come descritto nel manoscritto testuale. Quindi aggiungere cinque CFSE micromolare o Far Red e incubare le cellule per 30 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare attentamente il mezzo con il colorante e lavare le cellule due volte con cinque millilitri di PBS caldo.Successivamente, eseguire la digestione enzimatica con EDTA allo 05% di tripidi secondo le indicazioni del manoscritto. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Le cellule sono state rimonite in una matrice di membrana basale a uno ghiacciata e one-to-one e in un mix di mezzi di coltura per la formazione di prostasfera 3D.Per preparare la coltura della prostasfera in un sistema a matrice basale 3D, scongelare la matrice della membrana basale a quattro gradi Celsius durante la notte e tenerla sul ghiaccio prima dell'uso. Quindi aggiungere delicatamente un millilitro di matrice di membrana basale ghiacciata in un volume uguale di mezzo di coltura ghiacciato-freddo. Pipetta su e giù per mescolare, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.Resuspend cinque volte da 10 a 1/4 cellule epiteliali della prostata umana nella matrice di membrana basale uno-a-uno ghiacciata e nel mix di mezzi di coltura per un volume totale di 500 microlitri. Pipettare la soluzione sul bordo inferiore di ogni pozzo e ruotare la piastra per distribuire uniformemente la miscela. Posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire alla matrice di solidificarsi.Quindi coprirlo con un millilitro di mezzo di coltura caldo per pozzo, assicurandosi di non disturbare l'anello. Per raccogliere le prostasfere etichettate CFSE sostituire il mezzo con due millilitri dispasi e pipetta su e giù per mescolare più volte. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti per digerire la matrice, quindi raccogliere la miscela di sfera in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.Centrifugare le sfere a 500 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Resuspend il pellet in 500 microlitri di EDTA caldo allo 05% di tripside e trasferirli in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Incubare le sfere a 37 gradi Celsius per cinque minuti, quindi aggiungere 500 microlitri di PBS caldo con 10%FBS.Passali attraverso una siringa da un millilitro con un ago calibro 26 per dissociare completamente le sfere. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti. Quindi aspirare e scartare il supernatante.Resopendare le cellule in un millilitro di mezzo di coltura calda con un microgrammo per millilitro propidioduro per macchiare le cellule morte e incubarle per un minuto a temperatura ambiente. Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante. Quindi lavare le cellule con un millilitro di mezzo caldo.Ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante. Rimescolare le cellule in un millilitro di mezzo di coltura caldo e raccogliere le cellule in tubi inferiori rotondi in polistirolo da cinque millilitri filtrandole attraverso tappi a scatto a pressione cellulare di dimensioni dei pori da 35 micron. Eseguire l'analisi FACS delle cellule prostasfera con etichetta CFSE disperse in tripina.Utilizzando celle non etichettate come controllo negativo e celle etichettate CFSE come controllo positivo per impostare i gate, eseguire il campione per ordinare e raccogliere le sottopopolazioni di cellule frazionate ad alto CFSE e CFSE-low. Le cellule epiteliali primarie normali della prostata umana sono state collocate in piatti di coltura rivestiti di fibronectina e la crescita cellulare è stata mantenuta nella coltura 2D. Dopo il trasferimento in una coltura 3D con una matrice di membrana basale, le cellule epiteliali differenziate si escono lentamente e solo le cellule staminali della prostata sono rimaste.La doppia etichettatura delle cellule epiteliali prostatiche in coltura 2D seguita dalla formazione di sferoidi nella coltura 3D ha mostrato la colocalizzazione di BrdU, CFSE e Far Red nelle stesse cellule che mantengono l'etichetta. La doppia immunostaining ha dimostrato che le cellule che mantengono l'etichetta mostrano livelli più bassi di cheratina proteica di citocheratina 14, diminuzione della proteina di giunzione cellulare E-cadherin, aumento delle proteine marcatori precoci delle cellule staminali Wnt10b e ALDH1A1, aumento della proteina autofagia LC3 e aumento della miosina IIB. Inoltre, il test di ritenzione delle etichette a base di sferoide rileva con successo cellule simili a staminali tumorali negli esemplari di cancro alla prostata.Le cellule tumorali e gli sferoidi con etichetta CFSE che mantengono cellule tumorali simili a staminali e sferoidi derivati da campioni di cancro alla prostata umano presentavano una proteina E-cadherina ridotta rispetto alle cellule progenitrici non etichettate. Quando si tenta questo protocollo, è importante mantenere la matrice in forma liquida per la preparazione del mezzo di coltura. Conservarlo durante la notte a quattro gradi e raffreddare le punte delle pipette in PBS ghiacciato prima della matrice di erogazione.Dopo l'isolamento delle cellule staminali utilizzando il saggio di ritenzione di etichette a base di sferoide, è possibile eseguire il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e l'analisi proteomica per identificare geni specifici e nuovi biomarcatori nelle cellule staminali. L'isolamento delle cellule staminali tumorali vive da parte del saggio di ritenzione di etichette a base di sferoide consente ai ricercatori di coltivare tumori derivati da cellule staminali tumorali in vitro e di migliorare nuovi farmaci antitumorali.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Istituzione di Cancer Stem colture cellulari da umana convenzionale osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

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Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

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This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...