Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
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이 연구는 국립 암 연구소 R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 시카고 일리노이 대학의 유동 세포 측정 코어에 세포 선별에 대한 도움을 주셔서 감사합니다.

모든 세포 처리 및 매질 제제는 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 (BSC)에서 무균 기술로 수행되어야한다.
1. 2D에서 HPrEC 세포의 배양 및 유지 보수
<ol><li>2.5 μg/cm2 fibronectin 용액2 mL로 100mm 배양 접시를 실온 (RT)에서 밤새 코팅하십시오. 용액을 흡인하고 배양접시를 BSC에서 45분 동안 건조시키게 하였다.</li>
	<li>전립선 상피 세포 성장 배지(예를 들어, PrEGM)의 9 mL를 섬유넥?...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

다중 줄기세포 표면 마커를 이용한 유세포측정법은 특이성과 선택성 모두 결여에도 불구하고 줄기세포 연구를 위해 일반적으로 사용되는접근법1,5,6. 3D 배양 시스템에서 스페로이드 형성은 HPrEC를 포함하는 1 차 상피 세포로부터 희귀 줄기 세포 집단을 풍부하게 하는 또 다른 유용한 방법이지만, 생성된 스페로이드는 여전히 ?...

인간 전립선은 분비 기능과 특이한 신경 내분비 세포 성분과 함께 기본 기저 세포를 가진 발광 상피를 포함합니다. 상피 세포는, 이 경우에, 생체 내에서 상대적으로 정지하고 일생 내내 선 항상성을 유지하기 위하여 복구 시스템으로 작용하는 전립선 줄기 세포의 희소한 인구에서 생성됩니다1. 많은 발전에도 불구하고, 전립선 줄기 세포의 식별 및 기능적 격리는 분야에서 중요한 과제로 남아 있습니다. 세포 표면 마커 기반 방법론을 포함하는 줄기 세포 바이오마커는 유세포 분석과 결합되어 줄기세포 연구2,3,4에일반적으로 사용된다. 그러나, 농축 및 격리에 대한 결과는 마커 조합 및 항체 특이성의 함수로서 광범위하게변화하며,6,단리된 세포의 정체성에 대한 의문을 제기한다. 줄기형 세포 농축을 위한 또 다른 널리 사용되는 접근법은 3차원(3D) 스페로이드배양2,3,4이다. 상주 줄기세포는 틈새 구속을 가진 생체 내에서 상대적으로 정지되어 있는 반면, 이들은 3D 매트릭스 배양(대칭 및 비대칭 둘 다)에서 세포 분열을 겪고, 줄기 세포와 전구 세포를 모두 생성하여 계보약정7,8을향해 빠르게 재생한다. 형성된 스페로이드는 초기 및 후기 전구 세포를 포함하여 계보 헌신의 각종 단계에서 줄기 세포 및 전구 세포를 모두 포함하는 이기종 혼합물입니다. 따라서, 전체 스페로이드를 이용한 세포는 줄기 세포 배타적이지 않으며, 독특한 줄기 세포 특성의 식별이 결정적이지 않다. 따라서, 그들의 딸 전구에서 전립선 줄기 세포를 확인하고 분리하기 위하여 분석사를 만드는 것이 중요합니다. 이를 위해, 현재 프로토콜의 목표는 인간 전립선 조직으로부터 줄기 세포를 효율적으로 식별하고 분리할 수 있는 분석 시스템을 수립하고 생물학적 기능에 대한 강력한 하류 분석을 하는 것입니다.
장기 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU) 라벨-보유는 그들의 장기간 두 배의 시간9,10에기초하여 줄기 세포의 생체 내 및 시험관 내 계보 추적에 널리 사용된다. 본원에 기재된 전립선 줄기 세포 식별 및 격리에 대한 현재의 접근법은 혼합 상피 집단 내에서 그들의 상대적 정지 특성 및 라벨 보유 특성에 기초한다. 더욱이, 불멸의 가닥 DNA 가설에 기초하여, 오직 줄기 세포만이 비대칭 세포 분열을 겪을 수 있다. 줄기 세포는 더 오래된 부모 DNA를 포함하는 딸 세포를 나타내고, 전구 세포는, 투입된 딸 세포인, 새로 합성된 DNA를 수신합니다. 위에서 설명한 독특한 줄기 세포 특성은 1 차 적인 배양에서 부모 줄기 세포에서 BrdU 라벨을 수행하고 3D 앵커가없는 스페로이드 배양으로 옮길 때 BrdU 세척 다음 라벨을 추적하기 위해 악용됩니다. 1차 전립선 상피 세포의 대다수가 2D 배양에서 기저 및 이동 증폭 표현형을 유지하는 반면, 3D시스템으로전달시 해당 배양 배지를 가진 구형 또는 완전히 분화된 오르가노이드의 형성에 의해 입증된 바와 같이 상피 항상성을 보충하고 유지하는 다능성 줄기 세포의 드문 집단이 있다3,12. 현재 프로토콜에서, HPrEC 전립선 스페로이드 또는 프로스타스피어 계 BrdU, CFSE, 또는 원적 보유 분석법에 이어 형광 활성 세포 선별(FACS)을 사용하여, 단일 세포 수준13에서스페로이드에서 라벨 유지 줄기 세포를 식별합니다.
중요한 것은, 우리는 계보 투입을 가진 전구 세포에 비교된 초기 단계 스페로이드 내의 표지 보유 세포의 줄기 세포 특성을 추가로 확인했습니다. 이들은 줄기 세포 비대칭 분열, 시험관 내 스페로이드 형성 능력 및 생체 외 조직 재생 능력, 높은 autophagy 활동, 증강 리보솜 생물 발생 및 감소된 신진 대사 활동을 포함합니다. 이어서, RNAseq 분석을 수행하였습니다. 표지 유지 스페로이드 세포에서 분과적으로 발현된 유전자는 인간 전립선 줄기 세포에 대한 신규한 바이오마커로서 작용할 수 있음을 관찰하였다. 이러한 스페로이드 계 라벨-고정 접근법은 암 표본에 적용하여 소수의 암 줄기 유사 세포를 유사하게 식별할 수 있으며, 따라서 치료 내성집단(13)을관리할 수 있는 번역 기회를 제공한다. 아래에 제시된 것은 인간 1차 전립선 상피 세포(HPrEC)를 예로 사용하는 전립선계 라벨 보유 분석이다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

성인 줄기 세포 연구에 있는 어드밴스에도 불구하고, 조직 견본에서 줄기 세포의 확인 그리고 격리는 중요한 도전남아 있습니다. 상주 줄기 세포는 성인 조직에 틈새 구속으로 상대적으로 정지하는 동안, 그들은 앵커없는 3 차원 (3D) 배양에서 세포 주기를 입력하고 대칭 및 비대칭 세포 분열을 모두 겪으며 줄기와 전구 모두를 초래합니다. 셀. 후자는 급속하게 증식하고 이질적인 스페로이드를 형성하는 계보 헌신의 각종 단계에서 중요한 세포 인구입니다. 일차 정상 인간 전립선 상피 세포(HPrEC)를 사용하여, 스페로이드 기반의 라벨 보존 분석법으로 단일 세포 분해능에서 스페로이드 를 발동하는 줄기 세포의 식별 및 기능적 분리를 허용하는 것으로 개발되었다.
HPrEC 또는 세포주들은 2차원(2D) BrdU와 함께 10일 동안 배양되어 자가 갱신 줄기 세포를 포함한 모든 분할 세포의 DNA에 혼입하는 것을 허용한다. 5 일 동안 3D 배양으로 옮겨지면 씻어 내고, 그 동안 줄기 세포는 비대칭 분열을 통해 스스로 갱신하고 스페로이드 형성을 시작합니다. 상대적으로 정지딸 줄기세포가 BrdU 표지된 부모 DNA를 유지하는 동안, 딸 선조는 BrdU 라벨을 잃고 급속하게 증식합니다. BrdU는 FACS에 의한 살아있는 줄기 세포 격리를 허용하는 CFSE 또는 파 레드 프로 염료로 대체될 수 있습니다. 줄기 세포 특성은 생체 외 스페로이드 형성, 생체 내 조직 재생 분석 및 대칭 / 비대칭 세포 분열을 문서화하여 확인됩니다. 단리된 라벨-유지 줄기 세포는 RNA-seq, ChIP-seq, 단세포 포획, 대사 활성, 프로테오메 프로파일링, 면역 세포 화학, 오르가노이드 형성 및 생체 내 조직 재생을 포함한 다운스트림 분자 및 생물학적 연구에 의해 엄격하게 심문될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 마커 자유로운 기능적인 줄기 세포 격리 접근은 다중 기관에서 신선한 암 견본 및 암 세포줄에서 줄기 같이 세포를, 넓은 적용성을 건의합니다. 암 줄기 와 같은 세포 바이오마커를 식별하고, 암 줄기와 같은 세포를 표적으로 하는 의약품을 선별하고, 암에서 새로운 치료 표적을 발견하는 데 사용할 수 있습니다.

일차 정상 인간 전립선 상피 세포는 섬유넥틴 코팅 배양 접시에 배치되고 세포 성장은 2D 배양물에서 유지된다(도1a). 지하 막 매트릭스를 가진 3D 문화로 옮겨질 때, 분화한 상피 세포는 천천히 죽습니다. 전립선 줄기 세포만이 5일 이내에 앵커 프리 배양 및 포름 스페로이드에서 생존할 수있다(도 1b).
2D 배?...

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Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

인간의 1차 전립선 상피 세포를 사용하여, 우리는 스페로이드 기반 의 라벨 보유 분석법에 의해 줄기 유사 세포의 기능적 특성화의 새로운 바이오마커 없는 방법을 보고합니다. BrdU, CFSE, 또는 파 레드 2D 셀 라벨링에 대해 단계별 프로토콜이 기재되어; 3 차원 스페로이드 형성; 면역 세포 화학에 의한 라벨-유지 줄기 유사 세포 식별; 및 FACS에 의해 격리.

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

줄기 세포 격리는 현재 방법을 사용하여 전구 세포의 공동 격리로 인해 주요 과제로 남아 있습니다. 우리는 혼합 선조에서 정지 줄기 세포를 분리하기 위해 새로운 바이오 마커없는 분석기를 개발했습니다. 이 스페로이드 기반의 주요 장점, 라벨 보존 분석, 그것은 확장하고 CFSE 또는 파 레드 라벨을 사용하여 FACS에 의해 자신의 딸 전조에서 라이브 줄기 세포를 분리 할 수 있습니다.종래의 치료법은 대부분의 전립선암세포를 근절하지만, 암줄기세포는 치료저항으로 인해 남아 있어 질병 진행을 유도한다. 줄기와 같은 세포 격리는 효과적인 질병 면제를 위한 치료적으로 공동 표적으로 할 수 있는 새로운 유전자의 확인을 허용할 것입니다. 우리의 라벨 보존 분석은 다양한 조직및 세포에서 정상적인 줄기 세포 격리에 적용, 암 줄기 세포 연구에 대한.중요한 것은, 이 분석은 유방과 대장암과 같은 그밖 상피 세포 암에 적용됩니다. 먼저 100mm 배양 접시에 2밀리리터 2.5 마이크로그램 섬유네틴 용액을 코팅하고 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 흡습하고 문화 요리가 생물 안전 캐비닛에서 45 분 동안 건조하게하십시오.전립선 상피 세포 성장 매체의 9 밀리리터를 섬유네틴 코팅 접시에 넣고 섭씨 37도에서 이산화탄소 인큐베이터에서 따뜻하게 유지하십시오. 냉동 인간 전립선 상피 세포의 한 유리병을 섭씨 37도 의 수조에서 해동하고, 따뜻한 매체의 10 밀리리터에서 세포를 재중단. 5분 동안 500배 g의 세포 현탁액을 원심분리합니다.그런 다음 흡인하고 상체를 폐기하십시오. 따뜻한 배양 배지의 1 밀리리터로 세포를 다시 중단하고 미리 데워진 배지로 섬유넥틴 코팅 된 접시에 서스펜션의 1 밀리리터를 직접 전달합니다. 그런 다음 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.세포를 공동 표지하는 경우 텍스트 원고에 설명된 대로 10일 2D 배양에서 BrdU 표지된 세포를 준비합니다. 그런 다음 5개의 마이크로몰러 CFSE 또는 파 레드를 추가하고 30 분 동안 세포를 배양합니다. 인큐베이션 후, 조심스럽게 염료로 매체를 흡인하고 따뜻한 PBS의 5 밀리리터로 세포를 두 번 세척.다음으로, 원고 의 방향에 따라 05 %의 트립신 EDTA로 효소 소화를 수행합니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오. 세포는 3D 프스타스피어 형성을 위한 얼음감기, 일대일 지하 막 매트릭스 및 배양 배지 혼합물로 재장매되었다.3D 지하 매트릭스 시스템에서 prostasphere 문화를 준비하기 위해, 지하실 막 매트릭스를 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 해동하고 사용하기 전에 얼음에 보관하십시오. 그런 다음 얼음차가운 지하 막 매트릭스 1밀리리터를 얼음냉식 배지에 부드럽게 넣습니다. 파이펫을 위아래로 섞어 기포를 도입하지 않도록 주의하십시오.500 마이크로리터의 총 부피에 대한 얼음 차가운 일대일 지하 막 매트릭스 및 배양 매체 믹스에서 5 회 10 ~ 1/4 인간의 전립선 상피 세포를 다시 중단합니다. 각 우물의 바닥 림에 대한 용액을 피펫하고 플레이트를 소용돌이어 혼합물을 균등하게 분배합니다. 플레이트를 섭씨 37도이산화탄소 인큐베이터에 30분간 배치하여 매트릭스가 고화되도록 합니다.그런 다음 링을 방해하지 않도록 잘 당 따뜻한 배양 매체의 1 밀리리터로 덮습니다. CFSE 라벨이 부착된 프로스타스피어를 수확하기 위해 배지를 두 밀리리터디스파스와 파이펫으로 대체하여 여러 번 섞습니다. 37°C의 플레이트를 30분간 배양하여 매트릭스를 소화한 다음 15밀리리터 원심분리기 튜브로 구체 혼합물을 수집합니다.5분 동안 500배 g의 원심분리하고 상체를 폐기합니다. 따뜻한 05%트립신 EDTA의 500 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 5분간 섭씨 37도에서 구체를 배양한 다음, 10%의 FBS로 500마이크로리터의 따뜻한 PBS를 추가합니다.26게이지 바늘로 1밀리리터 주사기를 통과하여 구체를 완전히 분리합니다. 5 분 동안 500 배 g에서 세포를 원심 분리합니다. 그런 다음 흡인하고 상체를 폐기하십시오.밀리리터 프로피듐 요오드당 1마이크로그램으로 따뜻한 배양 배지의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단하여 죽은 세포를 더럽히고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 원심분리를 반복하고 상체를 폐기한다. 그런 다음 따뜻한 매체의 1 밀리리터로 세포를 씻으시면 됩니다.원심분리를 반복하고 상체를 폐기한다. 따뜻한 배양 배지의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 35 미크론 모공 크기의 세포 스트레이너 스냅 캡을 통해 여과하여 5 밀리리터 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브에서 세포를 수집합니다. 트립신 분산 CFSE 라벨 프로스타스피어 세포의 FACS 분석을 수행합니다.비표지 된 세포를 음성 제어로 사용하고 CFSE 표지 된 세포를 긍정적 인 제어로 사용하여 게이트를 설정하고 샘플을 실행하여 분획 된 CFSE 높음 및 CFSE 로우 셀의 하위 집단을 정렬하고 수집합니다. 1차 정상 인간 전립선상피세포는 섬유넥틴 코팅 배양기및 세포 성장으로 2D 배양에서 유지되었다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양으로 옮겨가면, 분화한 상피 세포는 천천히 밖으로 정지하고 단지 전립선 줄기 세포만 남아 있었습니다.3D 배양에서 스페로이드 형성에 이어 2D 배양에서 전립선 상피 세포의 이중 라벨링은 동일한 라벨 유지 세포에서 BrdU, CFSE 및 Far Red의 지역화를 보였다. 이중 면역스테인닝세포는 세포종단백질 케라틴 14, 세포정결 단백질 E-cadherin 감소, 줄기세포 조기 마커 단백질 Wnt10b 및 ALDH1A1 증가, 자가단백질 LC3 증가, myosin IIB 증가 등을 나타냈다. 더욱이, 스페로이드 기반의 라벨 보존 분석체는 전립선암 편형에서 암 줄기와 같은 세포를 성공적으로 검출합니다.CFSE 표지된 유지 줄기 유사 암세포 및 인간 전립선암 표본에서 유래한 스페로이드는 비표지된 전구 세포에 비해 감소된 E-cadherin 단백질을 나타냈다. 이 프로토콜을 시도할 때 배양 배지 준비를 위해 매트릭스를 액체 형태로 유지하는 것이 중요합니다. 하룻밤 동안 4도에 보관하고, 분배 매트릭스 전에 얼음 차가운 PBS에 파이펫 팁을 냉각.스페로이드 계 라벨 보존 분석을 이용하여 줄기 세포의 격리에 이어, 단세포 RNA 염기서열 분석은 줄기 세포에서 특정 유전자 및 새로운 바이오마커를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 스페로이드 계 라벨 보존 분석체에 의한 살아있는 암 줄기 세포의 격리는 연구원이 시험관내에서 암 줄기 세포 유래 종양을 성장시키고 새로운 항암제를 선별하는 것을 가능하게 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

암의 설립은 인간 기존의 골육종에서 세포 배양 줄기

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

연구

암 연구학

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

대장 HT29 유래 암 줄기 와 같은 종양스피어에서 드라이버 유전자의 발견

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...