Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Vi takker Flow flowcytometri Core ved University of Illinois i Chicago for assistanse på celle sortering.

Alle celle håndtering og Media preparater bør utføres med aseptisk teknikk i et klasse II biologisk sikkerhetskabinett (BSC).
1. kultur og vedlikehold av HPrEC celler i 2D
<ol><li>Coat 100 mm kultur retter med 2 mL 2,5 μg/cm2 fibronektin løsning over natten ved romtemperatur (RT). Aspirer løsningen og la kulturen retter luften tørr i BSC for 45 min. Fibronektin-belagte kultur retter kan oppbevares 2 – 4 uker ved 4 ° c.</li>
	<li>Tilsett 9 mL av prostata epitel cellevekst...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

Flow flowcytometri bruker flere Stem Cell Surface markører er en vanlig metode for stamcelleforskningen tross mangler både spesifisitet og selektivitet1,5,6. Mens spheroid formasjon i et 3D kultur system er en annen nyttig metode i berikende den sjeldne stilk cellen befolkning fra primære epitelceller, inkludert HPrEC, den resulterende spheroids er fortsatt en heterogen blanding av stammen og stamceller2</su...

Den menneskelige prostatakjertel inneholder luminal epitel med sekretoriske funksjon og basal celler underliggende det sammen med en uvanlig Nevroendokrine celle komponent. Epitelceller, i dette tilfellet, er generert fra en sjelden populasjon av prostata stamceller som er relativt Quiescent in vivo og fungere som et reparasjonssystem for å opprettholde kjertel homeostase gjennom hele livet1. Til tross for mange fremskritt, er identifisering og funksjonell isolering av prostata stamceller fortsatt en stor utfordring i feltet. Stem Cell biomarkører, inkludert Cell Surface markør-baserte metoder kombinert med Flow flowcytometri brukes vanligvis for stilk cellen forskning2,3,4. Men resultatene for berikelse og isolasjon varierer mye som en funksjon av markør kombinasjoner og antistoff spesifisitet5,6, heve spørsmål om identiteten til de isolerte cellene. En annen mye brukt tilnærming for Stem-lignende celle berikelse er tredimensjonal (3D) spheroid kultur2,3,4. Mens Resident stamceller er relativt Quiescent in vivo med nisje begrensninger, de gjennomgår celledeling i 3D Matrix kultur (både symmetrisk og asymmetrisk), genererer både stilk og stamceller som raskt reprodusere mot avstamning engasjement7,8. Dannet spheroids er en heterogen blanding som inneholder både stamceller og stamceller på ulike stadier av avstamning forpliktelse, inkludert tidlig og sent stadium stamceller. Dermed analyser ved hjelp av hele spheroids er ikke Stamcelle eksklusive, noe som gjør identifisering av unike stilk cellen egenskaper mangelfulle. Derfor er det avgjørende å lage analyser for å identifisere og skille prostata stamceller fra deres datter forfedre. Mot dette formålet, er målet med den nåværende protokollen for å etablere en analysesystem som gjør det mulig for effektiv identifisering og isolering av stamceller fra humant prostata vev etterfulgt av robust nedstrøms analyse av deres biologiske funksjoner.
Langsiktig 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) Label-oppbevaring er mye brukt for in vivo og in vitro avstamning tracing av stamceller basert på deres forlenget dobling tid9,10. Den nåværende tilnærmingen for prostata stilk cellen identifisering og isolasjon beskrevet her er basert på deres relative Quiescent karakteristiske og etikett-oppbevaring egenskaper innenfor en blandet epitel befolkning. Videre, basert på den udødelige Strand DNA-hypotesen, kan bare stamceller gjennomgå asymmetrisk celledeling. Stam cellen representerer datter cellen som inneholder det eldre foreldrenes DNA, mens Stam cellen, som er en engasjert datter celle, mottar det nylig syntetisert DNA. Den unike stilk cellen eiendom beskrevet ovenfor er utnyttet til å utføre BrdU merking i foreldrenes stamceller i primære kulturer og deretter spore sin etikett etter BrdU-bleke ved overføring til 3D-anker-fri spheroid kultur. Mens flertallet av primær prostata epitelceller beholde en basal og transitt forsterke fenotype i 2D kultur, er det også en sjelden befolkning på Multipotent stamceller fylle og vedlikeholde epitel homeostase som dokumentert ved dannelse av spheroids eller fullt differensiert organoids med tilsvarende kultur Media ved overføring til 3D-systemer3,12. I vår nåværende protokoll, ved hjelp av HPrEC prostata spheroids eller prostasphere-baserte BrdU, CFSE, eller far Red oppbevaring analyser etterfulgt av fluorescens aktivert celle sortering (FACS), identifiserer vi etikett-beholder stamceller i spheroids på en enkelt cellenivå13.
Viktigere, vi bekreftet ytterligere Stamcelle egenskapene til etikett-beholde celler innen tidlig stadium spheroids i forhold til stamceller med avstamning forpliktelse. Disse inkluderer stilk cellen asymmetrisk divisjon, in vitro spheroid dannelse evne og in vivo vev gjenfødelse kapasitet, forhøyet autofagi aktivitet, utvidet ribosom kognitiv og redusert metabolsk aktivitet. Deretter ble RNAseq-analysen utført. Differensielt uttrykte gener i etikett-beholder spheroid celler ble observert som kan tjene som romanen biomarkører for humant prostata stamceller. Dette spheroid-basert etikett-beholder tilnærming kan gjelde for kreft prøver å tilsvarende identifisere et lite antall kreft stilk-lignende celler, og dermed gi translational muligheter til å håndtere den terapeutiske resistente populasjoner13. Presentert nedenfor er prostasphere-baserte Label-oppbevaring analysen bruker menneskelige primære prostata epitelceller (HPrEC) som et eksempel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

Til tross for fremskritt i voksen stamcelleforskningen, er identifisering og isolering av stamceller fra vevsprøver fortsatt en stor utfordring. Mens bosatt stamceller er relativt Quiescent med nisje begrensninger i voksen vev, de kommer inn i cellen syklus i anker-fri tredimensjonal (3D) kultur og gjennomgår både symmetrisk og asymmetrisk celledeling, noe som gir opphav til både stilk og stamfar Celler. Sistnevnte sprer raskt og er den store cellen befolkning på ulike stadier av avstamning forpliktelse, danner heterogene spheroids. Ved hjelp av primære normal humant prostata epitelceller (HPrEC), en spheroid-basert, etikett-oppbevaring analysen ble utviklet som tillater identifisering og funksjonell isolering av spheroid-initiering stamceller på en enkelt celle oppløsning.
HPrEC eller cellelinjer er to-tredimensjonalt (2D) kultivert med BrdU i 10 dager for å tillate sin innlemmelse i DNA av alle dele celler, inkludert selv fornyelse stamceller. Vask ut starter ved overføring til 3D-kulturen i 5 dager, der stamceller selv fornye gjennom asymmetrisk divisjon og initiere spheroid formasjon. Mens relativt Quiescent datter stamceller beholde BrdU-merket foreldrenes DNA, datteren forfedre raskt sprer, mister BrdU etiketten. BrdU kan erstattes med CFSE eller far Red Pro-fargestoffer, som tillater levende stilk cellen isolasjon av FACS. Stem celle egenskaper bekreftes av in vitro spheroid formasjon, in vivo vev regenerering analyser, og ved å dokumentere deres symmetrisk/asymmetrisk celle divisjoner. Den isolerte etikett-beholde stamceller kan bli grundig avhørt av nedstrøms molekylære og biologiske studier, inkludert RNA-SEQ, ChIP-SEQ, enkelt celle fangst, metabolsk aktivitet, proteom profilering, immuncytokjemi, organoid formasjon, og in vivo vev gjenfødelse. Viktigere, identifiserer denne markøren-fri funksjonell stilk cellen isolasjon tilnærming stilk-lignende celler fra fersk kreft prøver og kreftcelle linjer fra flere organer, noe som tyder på bred relevans. Den kan brukes til å identifisere kreft stilk-lignende celle biomarkører, skjermen legemidler rettet mot kreft stilk-lignende celler, og oppdage romanen terapeutiske mål i kreft.

Primær normal humant prostata epitelceller er plassert i fibronektin-belagt kultur retter og cellevekst opprettholdes i 2D kultur (figur 1a). Ved overføring til 3D-kultur med en kjeller membran matrise, differensiert epitelceller langsomt dø ut. Bare prostata stamceller kan overleve i et anker-fri kultur og form spheroids i 5 dager (figur 1b).
Dobbel merking av prostata epitelceller i 2D kultur ett...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Ved hjelp av humant primære prostata epitelceller, rapporterer vi en roman biomarkør-fri metode for funksjonell karakterisering av stilk-lignende celler ved en spheroid-basert etikett-oppbevaring analysen. En trinnvis protokoll er beskrevet for BrdU, CFSE eller far Red 2D cellemerking; tredimensjonal spheroid formasjon; Label-beholder stilk-lignende celle identifisering av immuncytokjemi; og isolert av FACS.

Isolering av Stem-lignende celler fra 3-dimensjonale spheroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Stamcelleisolasjon er fortsatt en stor utfordring på grunn av samtidig isolering av stamceller ved hjelp av dagens metoder. Vi utviklet en ny biomarkørfri analyse for å isolere quiescent stamceller fra blandede forfedre. Den største fordelen med denne sfæroidbaserte, etikettoppbevaringsanalysen, kan den utvide og isolere levende stamceller fra deres datters forfedre ved hjelp av CFSE eller Far Red-merking.Mens konvensjonelle terapier utrydde de fleste prostatakreftceller, kreft stamceller forblir på grunn av terapeutisk motstand, og dermed drive sykdomsprogresjon. Stamcelleisolasjon vil tillate identifisering av nye gener som kan være terapeutisk co-målrettet for effektiv sykdomsremisjon. Vår etikett-oppbevaring analyse gjelder for normal stamcelleisolasjon fra ulike vev og celler, og for kreft stamcelleforskning.Viktigere, denne analysen gjelder for andre epitelcellekreft, som bryst og kolorektal kreft. Begynn med å belegge 100 millimeter kulturretter med to milliliter 2,5 mikrogram fibronectinløsning og inkubere dem over natten ved romtemperatur. Deretter aspirerer løsningen og lar kulturrettene lufttørke i biosikkerhetsskapet i 45 minutter.Tilsett ni milliliter av prostata epitelcellevekstmedium til en fibronectinbelagt tallerken og hold den varm i karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius. Tin ett hetteglass med frosne humane prostata epitelceller i et 37 grader Celsius vannbad, og gjenbruke cellene i 10 milliliter varmt medium. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 500 ganger g i fem minutter.Deretter aspirerer og kast det overnaturlige. Resuspend cellene i en milliliter varm kultur medium og overføre en milliliter av suspensjonen direkte til fibronectin-belagt parabolen med pre-oppvarmet medium. Inkuber deretter parabolen i karbondioksidinkubatoren ved 37 grader Celsius.Hvis du merker cellene samtidig, kan du forberede BrdU-merkede celler i 10-dagers 2D-kultur som beskrevet i tekstmanuskriptet. Deretter legger du til fem mikromolar CFSE eller Far Red og inkubere cellene i 30 minutter. Etter inkubasjonen aspirerer du forsiktig mediet med fargestoffet og vask cellene to ganger med fem milliliter varm PBS.Deretter utfører du enzymatisk fordøyelse med 05% trypsin EDTA i henhold til manuskriptets retninger. Sentrifuger cellene ved 500 ganger g i fem minutter og kast supernatanten. Cellene ble gjenbrukt i iskald, en-til-en kjeller membran matrise og kultur medium blanding for 3D prostasphere formasjon.For å forberede prostasphere kultur i en 3D kjeller matrise system, tine kjelleren membran matrise på fire grader Celsius over natten og holde den på is før bruk. Tilsett deretter forsiktig en milliliter iskald kjellermembranmatrise i et likt volum iskaldt kulturmedium. Pipette opp og ned for å blande, ta vare på å ikke introdusere luftbobler.Gjenoppbruk fem ganger 10 til 1/4 humane prostata epitelceller i iskalde en-til-en kjeller membran matrise og kultur media blanding for totalt volum på 500 mikroliter. Pipette oppløsningen til den nederste kanten av hver brønn og virvle platen for å fordele blandingen jevnt. Legg platen i en 37 grader Celsius karbondioksid inkubator i 30 minutter for å la matrisen stivne.Dekk deretter det med en milliliter varm kultur medium per godt, og sørg for å ikke forstyrre ringen. For å høste cfse-merkede prostaspheres erstatte mediet med to milliliter dispase og pipette opp og ned for å blande flere ganger. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i 30 minutter for å fordøye matrisen, og samle deretter sfæreblandingen i et 15-milliliter sentrifugerør.Sentrifuge kulene på 500 ganger g i fem minutter og kast supernatanten. Resuspend pellet i 500 mikroliter varme 05% trypsin EDTA, og overføre dem til en 1,5-milliliter sentrifuge rør. Inkuber kulene ved 37 grader Celsius i fem minutter, og legg deretter til 500 mikroliter varme PBS med 10% FBS.Før dem gjennom en en-milliliter sprøyte med en 26-gauge nål for å fullstendig dissosiere kulene. Sentrifuger cellene ved 500 ganger g i fem minutter. Deretter aspirerer og kast det overnaturlige.Gjenoppusst cellene i ett milliliter varmt kulturmedium med ett mikrogram per milliliter propidiumjodid for å flekke de døde cellene og inkubere dem i ett minutt ved romtemperatur. Gjenta sentrifugeringen, og kast det overnaturlige. Vask deretter cellene med en milliliter varm medium.Gjenta sentrifugeringen, og kast det overnaturlige. Resuspend cellene i en milliliter varm kultur medium og samle cellene i fem milliliter polystyren runde bunnrør ved å filtrere dem gjennom 35-mikron pore størrelse celle sil snap caps. Utfør FACS-analyse av trypsinsprederte CFSE-merkede prostasphere-celler.Bruk av ikke-merkede celler som en negativ kontroll og CFSE-merkede celler som en positiv kontroll for å angi portene, kjør prøven for å sortere og samle underpopulasjonene av fraksjonerte CFSE-høye og CFSE-lave celler. Primære normale humane prostata epitelceller ble plassert i fibronectin-belagt kultur retter og cellevekst ble opprettholdt i 2D kultur. Ved overføring til en 3D-kultur med en kjellermembranmatrise døde differensierte epitelceller sakte ut og bare prostatastamceller forble.Dual-merking av prostata epitelceller i 2D-kultur etterfulgt av sfæroid dannelse i 3D-kultur viste colocalization av BrdU, CFSE, og Far Red i samme etikett-beholde celler. Dual immunostaining viste at etikett-beholdende celler viser lavere nivåer av cytokeratin protein keratin 14, redusert celle junction protein E-kadherin, økt stamcelle tidlig markør proteiner Wnt10b og ALDH1A1, økt autofagi protein LC3, og økt myosin IIB. Videre oppdager den sfæroidbaserte, etikettoppbevaringsanalysen vellykket kreftstamlignende celler i prostatakreftprøver.CFSE-merkede beholdende stamceller og sfæroider avledet fra prøver av human prostatakreft viste redusert E-kadherinprotein i forhold til de ikke-merkede stamcellene. Når du prøver denne protokollen, er det viktig å opprettholde matrise i flytende form for kultur medium forberedelse. Oppbevar den over natten i fire grader, og chill pipette tips i iskald PBS før dispensering matrise.Etter isolering av stamceller ved hjelp av sfæroidbaserte etikettoppbevaringsanalyser, kan encellede RNA-sekvensering og proteomisk analyse utføres for å identifisere spesifikke gener og nye biomarkører i stamceller. Isolering av levende kreft stamceller av sfæroid-baserte label-retention analyse gjør det mulig for forskere å vokse kreft stamcelle-avledede tumoroider in vitro og å screene nye anti-kreft medisiner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Etablering av Cancer Stem Cell Cultures fra Menneskelig Konvensjonell Osteosarkom

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utnytte Funksjonell genom Screening for å identifisere potensielt Novel narkotika mål i Cancer Cell spheroid kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Forberedelse og metabolske analysen av 3-dimensjonale Spheroid co kulturer av kreft i bukspyttkjertelen celler og fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering av tumor-initiere celler fra sarkom pasient-avledet Xenotransplantater

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering av menneskelig endotelceller fra Normal kolon og Colorectal Carcinoma - en forbedret protokoll

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Etterligne og manipulere bukspyttkjertelen Acinar til Ductal Metaplasi i 3-dimensjonale cellekultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering Cell levedyktighet og død i 3D spheroid kulturer av kreftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Oppdagelsen av drivergener i kolorektal HT29-avledede kreftstammelignende tumorsfærer

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...