Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Este estudo foi apoiado por subvenções do Instituto Nacional do Câncer R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Agradecemos ao Núcleo de Citometria Flow da Universidade de Illinois, em Chicago, pela assistência na triagem celular.

Todo o manuseio celular e os preparativos da mídia devem ser realizados com técnica asséptica em um armário de segurança biológica classe II (BSC).
1. Cultura e manutenção das células HPrEC em 2D
<ol><li>Casaco 100 mm pratos cultura com 2 mL de 2,5 μg/cm2 solução de fibronectina durante a noite à temperatura ambiente (RT). Ascute a solução e deixe os pratos culturais secarem o ar no BSC por 45 min. Pratos de cultura revestidos de fibronectina podem ser armazenados 2...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

O fluxo de citometria usando vários marcadores de superfície de células-tronco é uma abordagem comumente usada para pesquisa com células-tronco, apesar de não ter especificidade e seletividade1,5,6. Enquanto a formação esferóide em um sistema de cultura 3D é outro método útil para enriquecer a população de células-tronco raras de células epiteliais primárias, incluindo HPrEC, os esferóides resultantes ainda sã...

A próstata humana contém epitélio luminal com função de secretismo e células basais subjacentes, juntamente com um componente de célula neuroendócrina incomum. As células epiteliais, neste caso, são geradas a partir de uma população rara de células-tronco da próstata que são relativamente quiescentes in vivo e atuam como um sistema de reparo para manter a homeostase glandular ao longo da vida1. Apesar de muitos avanços, a identificação e isolamento funcional das células-tronco da próstata continua a ser um grande desafio no campo. Biomarcadores de células-tronco, incluindo metodologias baseadas em marcadores de superfície celular combinadas com citometria de fluxo são comumente usados para pesquisa de células-tronco2,3,4. No entanto, os resultados para enriquecimento e isolamento variam muito em função de combinações de marcadores e especificidade de anticorpos5,6,levantando questões sobre a identidade das células isoladas. Outra abordagem amplamente utilizada para o enriquecimento de células semelhantes a troncos é a cultura esferóide tridimensional (3D)2,3,4. Enquanto as células-tronco residentes são relativamente quiescentin vivo com restrições de nicho, elas passam por divisão celular na cultura da matriz 3D (simétrica e assimétrica), gerando células-tronco e progenitoras que se reproduzem rapidamente em direção ao compromisso de linhagem7,8. Os esferóides formados são uma mistura heterogênea contendo células-tronco e células progenitoras em vários estágios do compromisso de linhagem, incluindo células progenitoras em estágio inicial e tardio. Assim, os ensaios que utilizam todo o esferóides não são exclusivos de células-tronco, tornando a identificação de propriedades únicas de células-tronco inconclusivas. Portanto, é fundamental criar ensaios para identificar e separar as células-tronco da próstata de seus progenitores filhas. Para este fim, o objetivo do protocolo atual é estabelecer um sistema de ensaio que permita a identificação eficiente e isolamento das células-tronco dos tecidos da próstata humana seguido por uma análise robusta a jusante de suas funções biológicas.
A retenção de rótulos de 5 bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) a longo prazo é amplamente utilizada para o rastreamento de linhagem in vivo e in vitro de células-tronco com base em seu tempo de duplicação prolongada9,10. A abordagem atual para a identificação e isolamento de células-tronco da próstata descritas aqui é baseada em sua característica quiescente relativa e propriedades de retenção de rótulos dentro de uma população epiteliana mista. Além disso, com base na hipótese imortal do DNA da cadeia, apenas as células-tronco podem ser submetidas a divisão de células assimétricas. A célula-tronco representa a célula filha que contém o DNA parental mais velho, enquanto a célula progenitora, que é uma célula filha comprometida, recebe o DNA recém-sintetizado. A propriedade única de células-tronco descrita acima é explorada para realizar rotulagem BrdU em células-tronco parentais em culturas primárias e, em seguida, acompanhar seu rótulo após BrdU-washout após a transferência para a cultura esferóide sem âncora 3D. Enquanto a maioria das células epiteliais da próstata primária retém um fenótipo basal e de trânsito amplificando na cultura 2D, há também uma população rara de células-tronco multipotentes reabastecendo e mantendo a homeostase epitelial como evidenciado pela formação de esferóides ou organóides totalmente diferenciados com a mídia cultura correspondente após a transferência para sistemas 3D3,12. Em nosso protocolo atual, usando esféóides de próstata HPrEC ou BrdU à base de prostasphere, CFSE ou ensaios de retenção de far red seguidos de triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), identificamos células-tronco de retenção de rótulos em esferóides em um nível de célula única13.
Importante, confirmamos ainda mais as características das células-tronco das células de retenção de rótulos dentro de esferóides em estágio inicial em comparação com as células progenitoras com compromisso de linhagem. Estes incluem divisão assimétrica de células-tronco, capacidade de formação esferóide in vitro e capacidade de regeneração do tecido invivo, atividade de autofagia elevada, biogênese ribossoma aumentada e diminuição da atividade metabólica. Posteriormente, foi realizada a análise do RNAseq. Genes diferencialmente expressos em células esferóides de retenção de rótulos foram observados que podem servir como novos biomarcadores para células-tronco da próstata humana. Esta abordagem de retenção de rótulos à base de esferóide pode aplicar-se a espécimes de câncer para identificar de forma semelhante um pequeno número de células semelhantes a troncos de câncer, proporcionando assim oportunidades translacionais para gerenciar as populações resistentes terapêuticas13. Apresentado abaixo está o ensaio de retenção de rótulos baseado em prostasphere usando células epiteliais primárias da próstata humana (HPrEC) como exemplo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

Apesar dos avanços na pesquisa de células-tronco adultas, a identificação e o isolamento das células-tronco de espécimes de tecidos continua sendo um grande desafio. Enquanto as células-tronco residentes são relativamente quiescentes com restrições de nicho em tecidos adultos, elas entram no ciclo celular na cultura tridimensional (3D) livre de âncoras e passam por divisão de células simétricas e assimétricas, dando origem a tronco e progenitor Células. Este último proliferar rapidamente e são a população celular principal em vários estágios do compromisso de linhagem, formando esferóides heterogêneos. Usando células epiteliais de próstata humanas normais primárias (HPrEC), foi desenvolvido um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides que permite a identificação e o isolamento funcional das células-tronco que iniciam esferóides em uma única resolução celular.
HPrEC ou linhas celulares são bidimensionalmente (2D) cultivadas com BrdU por 10 dias para permitir sua incorporação no DNA de todas as células divisórias, incluindo células-tronco auto-renovadoras. Lavar começa após a transferência para a cultura 3D por 5 dias, durante os quais as células-tronco se auto-renovam através da divisão assimétrica e iniciam a formação esferóide. Enquanto as células-tronco filhas relativamente quiescentes retêm o DNA parental com rótulo BrdU, os progenitores da filha proliferam rapidamente, perdendo o rótulo BrdU. A BrdU pode ser substituída por CFSE ou Far Red pró-corantes, que permitem o isolamento de células-tronco vivas pela FACS. As características das células-tronco são confirmadas pela formação esferóide in vitro, ensaios de regeneração de tecidos invivo e documentando suas divisões de células simétricas/assimétricas. As células-tronco isoladas que retêm rótulos podem ser rigorosamente interrogadas por estudos moleculares e biológicos a jusante, incluindo RNA-seq, ChIP-seq, captura de células únicas, atividade metabólica, perfil proteoma, imunocitoquímica, formação organóide e regeneração in vivo do tecido. Importante, esta abordagem de isolamento de células-tronco funcionais sem marcadores identifica células-tronco de espécimes de câncer fresco e linhas de células cancerosas de vários órgãos, sugerindo ampla aplicabilidade. Ele pode ser usado para identificar o câncer de células-tronco biomarcadores, tela farmacêutica visando células-tronco de câncer, e descobrir novos alvos terapêuticos em cânceres.

As células epiteliais da próstata humana normal primária são colocadas em pratos culturais revestidos de fibronectina e o crescimento celular é mantido na cultura 2D (Figura 1a). Após a transferência para a cultura 3D com uma matriz de membrana do porão, células epiteliais diferenciadas morrem lentamente. Apenas as células-tronco da próstata podem sobreviver em uma cultura livre de âncora e formar esferóides em 5 dias (Figura 1<stro...

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Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Usando células epitelia de próstata primárias humanas, relatamos um novo método livre de biomarcadores de caracterização funcional de células semelhantes a troncos por um ensaio de retenção de rótulos à base de esferóides. Um protocolo passo a passo é descrito para a rotulagem de células BrdU, CFSE ou Far Red 2D; formação tridimensional de esferóides; identificação de células-tronco de retenção de rótulos por imunocitoquímica; e isolamento pela FACS.

Isolamento de células-tronco a partir de culturas esferóides tridimensionais

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

O isolamento das células-tronco continua sendo um grande desafio devido ao co-isolamento das células progenitoras usando métodos atuais. Desenvolvemos um novo ensaio sem biomarcadores para isolar células-tronco quiescentes de progenitores mistos. A principal vantagem deste ensaio de retenção de rótulos baseado em esferoides, pode expandir e isolar células-tronco vivas de seus progenitores filhas pela FACS usando a rotulagem CFSE ou Far Red.Enquanto as terapias convencionais erradicam a maioria das células cancerígenas da próstata, as células-tronco do câncer permanecem devido à resistência terapêutica, impulsionando assim a progressão da doença. O isolamento celular semelhante a tronco permitirá a identificação de novos genes que podem ser terapeuticamente co-alvo para uma remissão eficaz da doença. Nosso ensaio de retenção de rótulos é aplicável para o isolamento normal de células-tronco de vários tecidos e células, e para a pesquisa de células-tronco do câncer.É importante ressaltar que este ensaio é aplicável a outros cânceres epiteliais, como câncer de mama e colorretal. Comece por revestir pratos de cultura de 100 milímetros com dois mililitros de solução de fibronectina de 2,5 microgramas e incuba-los durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução e deixe os pratos de cultura secar no armário de biossegurança por 45 minutos.Adicione nove mililitros do meio de crescimento das células epiteliais da próstata a um prato revestido de fibronectina e mantenha-o aquecido na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Descongele um frasco de células epiteliais de próstata humana congeladas em um banho de água de 37 graus Celsius, e resuspense as células em 10 mililitros de meio quente. Centrifugar a suspensão da célula a 500 vezes g durante cinco minutos.Em seguida, aspirar e descartar o supernaspe. Resuspenque as células em um mililitro de meio de cultura quente e transfira um mililitro da suspensão diretamente para o prato revestido de fibronectina com o meio pré-aquecido. Em seguida, incubar o prato na incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.Se co-rotular as células, prepare células com rótulo brdU na cultura 2D de 10 dias, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, adicione cinco CFSE micromolar ou Far Red e incubar as células por 30 minutos. Após a incubação, aspire cuidadosamente o meio com o corante e lave as células duas vezes com cinco mililitros de PBS quente.Em seguida, realize a digestão enzimática com 05% de trippsina EDTA de acordo com as instruções do manuscrito. Centrifugar as células a 500 vezes g por cinco minutos e descartar o supernasce. As células foram resuspengidas em matriz de membrana de porão gelada, de um para um e cultura média para formação de prostafera 3D.Para preparar a cultura da prostássea em um sistema de matriz de porão 3D, descongele a matriz de membrana do porão a quatro graus Celsius durante a noite e mantenha-a no gelo antes de ser usada. Em seguida, adicione suavemente um mililitro de matriz de membrana de porão gelado em um volume igual de meio de cultura gelada. Pipeta para cima e para baixo para misturar, tomando o cuidado de não introduzir bolhas de ar.Resuspend cinco vezes 10 a 1/4 células epiteliais de próstata humana em matriz de membrana de porão gelada e mistura de mídia cultural para o volume total de 500 microlitadores. Pipete a solução para a borda inferior de cada poço e gire a placa para distribuir uniformemente a mistura. Coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus por 30 minutos para permitir que a matriz se solidifique.Em seguida, cubra-o com um mililitro de cultura quente por poço, certificando-se de não perturbar o anel. Para colher as prostaferas rotuladas por CFSE substitua o meio por dois mililitros despase e pipeta para cima e para baixo para misturar várias vezes. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos para digerir a matriz, em seguida, coletar a mistura da esfera em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.Centrifugar as esferas a 500 vezes g por cinco minutos e descartar o supernaspe. Resuspenque a pelota em 500 microlitadores de edta quente de 05%, e transfira-as para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Incubar as esferas a 37 graus Celsius por cinco minutos, depois adicione 500 microliters de PBS quente com 10% de FBS.Passe-os através de uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 26 para dissociar completamente as esferas. Centrifugar as células a 500 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspirar e descartar o supernaspe.Resuspend as células em um mililitro de meio de cultura quente com um micrograma por iodeto de propídio mililitro para manchar as células mortas e incuba-las por um minuto à temperatura ambiente. Repita a centrifugação e descarte o supernatante. Em seguida, lave as células com um mililitro de meio quente.Repita a centrifugação e descarte o supernatante. Resuspend as células em um mililitro de meio de cultura quente e colete as células em tubos de fundo redondos de poliestireno de cinco mililitros filtrando-as através de tampas de estote de 35 mícrons de tamanho de células. Realize a análise FACS das células de prostafera com células de prostafera com rótulo CFSE dispersos de trippsina.Usando células não rotuladas como um controle negativo e células rotuladas por CFSE como um controle positivo para definir os portões, executar a amostra para classificar e coletar as subpopulações de células fracionadas CFSE-alta e CFSE-low. As células epiteliais normais da próstata humana primária foram colocadas em pratos de cultura revestidos de fibronectina e o crescimento celular foi mantido na cultura 2D. Após a transferência para uma cultura 3D com uma matriz de membrana de porão, células epiteliais diferenciadas lentamente morreram e apenas células-tronco da próstata permaneceram.A rotulagem dupla de células epiteliais de próstata na cultura 2D seguida pela formação esferoide na cultura 3D mostrou colocalização de BrdU, CFSE e Far Red nas mesmas células de retenção de rótulos. A imunostaining dupla mostrou que as células que retêm rótulos apresentam níveis mais baixos de queratina da proteína citokeratina 14, diminuição da proteína de junção celular E-cadherin, aumento das proteínas marcadores precoces de células-tronco Wnt10b e ALDH1A1, aumento da proteína de autofagia LC3, e aumento da miosina IIB. Além disso, o ensaio de retenção de rótulos baseado em esferoides detecta com sucesso células cancerígenas semelhantes a câncer em amostras de câncer de próstata.Células cancerígenas de retenção com rótulos CFSE e esferoides derivados de amostras de câncer de próstata humana apresentaram proteína e-cadherin reduzida em relação às células progenitoras não rotuladas. Ao tentar este protocolo, é importante manter matriz em forma líquida para preparação média da cultura. Armazene-o durante a noite a quatro graus, e esfrie as pontas da pipeta em PBS gelado antes de dispensar a matriz.Após o isolamento das células-tronco usando o ensaio de retenção de rótulos baseado em esferoide, o sequenciamento de RNA unicelular e a análise proteômica podem ser realizados para identificar genes específicos e novos biomarcadores em células-tronco. O isolamento de células-tronco de câncer vivos pelo ensaio de retenção de rótulos baseado em esferoides torna possível que os pesquisadores cresçam tumoróides derivados de células-tronco do câncer in vitro e viam novas drogas anticânculares.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Pesquisa do câncer

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolamento de células endoteliais humanas do cólon Normal e Carcinoma colorrectal - um protocolo melhorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Imitando e manipulando Metaplasia acinares-para-Ductal pancreático na cultura de pilha 3-dimensional

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...