Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами Национального института рака R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Мы благодарим Flow Cytometry Core в Университете Иллинойса в Чикаго за помощь в сортировке клеток.

Все обработки клеток и средств массовой информации препараты должны быть выполнены с асептической техникой в классе II биологической безопасности кабинета (BSC).
1. Культура и содержание ячеек HPrEC в 2D
<ol><li>Пальто 100 мм культуры блюда с 2 мл 2,5 мкг /см2 фибронектина раство...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

Цитометрия потока с использованием нескольких маркеров поверхности стволовых клеток является широко используемым подходом для исследования стволовых клеток, несмотря на отсутствие как специфичности, так и избирательности1,5,6. В то в?...

Человеческая предстательная железа содержит светящийся эпителий с секреторной функцией и базальные клетки, лежащие в ее основе вместе с необычным нейроэндокринным компонентом клеток. Эпителиальные клетки, в этом случае, генерируются из редкой популяции стволовых клеток простаты, которые являются относительно затихи в vivo и выступать в качестве системы ремонта для поддержания железистого гомеостаза на протяжении всей жизни1. Несмотря на многие достижения, выявление и функциональная изоляция стволовых клеток простаты остается серьезной проблемой в этой области. Биомаркеры стволовых клеток, в том числе клеточной поверхности маркера на основе методологии в сочетании с цитометрией потока обычно используются для исследования стволовых клеток2,3,4. Тем не менее, результаты для обогащения и изоляции сильно различаются в зависимости от функции маркерных комбинаций и антитела специфичность5,6,поднимая вопросы о личности изолированных клеток. Другой широко используемый подход для стволовых, как обогащение клеток является трехмерной (3D) сфероидной культуры2,3,4. В то время как резидентов стволовых клеток относительно тихие in vivo с нишевыми ограничениями, они проходят деление клеток в 3D матричной культуры (как симметричные и асимметричные), генерации как стволовых и прародителей клеток, которые быстро размножаются к линии обязательств7,8. Сформированные сфероиды представляют собой разнородную смесь, содержащую как стволовые клетки, так и клетки-прародители на различных стадиях обязательств линии, включая клетки-прародители ранней и поздней стадии. Таким образом, анализы с использованием целых сфероидов не являются исключительными стволовыми клетками, что делает идентификацию уникальных свойств стволовых клеток неубедительной. Поэтому, очень важно создать анализы для выявления и отделения стволовых клеток простаты от их дочери-прародителей. С этой целью цель нынешнего протокола заключается в создании системы анализа, которая позволяет эффективно выявлять и изоляцию стволовых клеток из тканей предстательной железы человека с последующим тщательным анализом их биологических функций.
Долгосрочный 5-бромо-2'-deoxyuridine (BrdU) этикетка-удержание широко используется для in vivo и in vitro lineage отслеживания стволовых клеток на основе их длительного удвоения времени9,10. Нынешний подход к идентификации и изоляции стволовых клеток простаты, описанный в настоящем документе, основан на их относительных тихих характеристиках и свойствах удержания этике в смешанной эпителиальной популяции. Кроме того, на основе гипотезы бессмертной нити ДНК, только стволовые клетки могут пройти асимметричное деление клеток. Стволовая клетка представляет собой дочернюю клетку, которая содержит более старую родительскую ДНК, в то время как клетка-прародитель, которая является клеткой-приверженной дочерью, получает недавно синтезированную ДНК. Уникальное свойство стволовых клеток, описанное выше, используется для выполнения маркировки BrdU в родительских стволовых клетках в первичных культурах, а затем отслеживать их этикетку после BrdU-вымывания при переходе к 3D-безякорной культуре сфероидов. В то время как большинство первичных эпителиальных клеток простаты сохраняют базальный и транзитный усиливающий фенотип в 2D-культуре, есть также редкая популяция многопотентных стволовых клеток, пополняя и поддерживая эпителиальный гомеостаз, о чем свидетельствует образование сфероидов или полностью дифференцированных органоидов с соответствующими культурами при передаче в 3D-системы3,12. В нашем текущем протоколе, с помощью HPrEC простаты сфероидов или простасфера основе BrdU, CFSE, или Дальнекрасный удержания анализы следуют флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS), мы определяем этикетки удерживающих стволовых клеток в сфероидов на уровне одной клетки13.
Важно отметить, что мы также подтвердили характеристики стволовых клеток клеток, удерживающих этикетку в сфероидах на ранней стадии, по сравнению с клетками-прародителями с родословной. К ним относятся асимметричное деление стволовых клеток, способность образования сфероидов in vitro и способность регенерации тканей in vivo, повышенная аутофагия, увеличенный биогенеза рибосомы и снижение метаболической активности. Впоследствии был проведен анализ РНАЗЕКа. По дифференциально выраженные гены в сфероидных клетках, сохраняющих этикетку, были замечены, которые могут служить новыми биомаркерами для стволовых клеток простаты человека. Этот сфероид на основе этикетки удерживая подход может применяться к образцам рака аналогичным образом определить небольшое количество раковых стволовых клеток, тем самым обеспечивая переводческие возможности для управления терапевтической резистентной популяции13. Ниже представлен prostasphere основе этикетки удержания асссс использованием основных эпителиальных клеток простаты человека (HPrEC) в качестве примера.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

Несмотря на достижения в исследованиях стволовых клеток взрослых, выявление и изоляция стволовых клеток от образцов тканей остается серьезной проблемой. В то время как резидентные стволовые клетки относительно тихие с нишевыми удерживающими устройствами во взрослых тканях, они входят в клеточный цикл в трехмерной (3D) культуре и проходят как симметричное, так и асимметричное деление клеток, что приводит как к стеблю, так и к прародителю Клетки. Последние быстро размножаются и являются основной популяцией клеток на различных стадиях линии обязательств, образуя неоднородные сфероиды. С использованием первичных нормальных человеческих эпителиальных клеток простаты (HPrEC), сфероид основе, этикетки удержания асссбыл был разработан, что позволяет идентификации и функциональной изоляции сфероидов инициирующих стволовых клеток в одном разрешении клеток.
HPrEC или клеточные линии двухмерно (2D) культивируются с BrdU в течение 10 дней, чтобы позволить его включение в ДНК всех разделительных клеток, в том числе самообновляющихся стволовых клеток. Вымыть начинается после переноса в 3D-культуру на 5 дней, в течение которых стволовые клетки самообновляются через асимметричное деление и инициируют образование сфероидов. В то время как относительно тихие стволовые клетки дочери сохраняют родительскую ДНК, помеченную BrdU, потомки дочери быстро размножаются, теряя этикетку BrdU. BrdU можно заменить CFSE или Far Red pro-dyes, которые позволяют изоляцию стволовых клеток в реальном маштабе времени FACS. Характеристики стволовых клеток подтверждаются образованием сфероидов in vitro, анализами регенерации тканей in vivo и документированием их симметричных/асимметричных делений клеток. Изолированные этикетки удерживающих стволовых клеток могут быть тщательно допрошены вниз по течению молекулярных и биологических исследований, в том числе РНК-сек, ChIP-seq, одноклеточного захвата, метаболической активности, протеоме профилирования, иммуноцитохимии, органоидного образования, и in vivo ткани регенерации. Важно отметить, что этот подход, свободный от маркеров функциональной изоляции стволовых клеток, определяет стволовые клетки из свежих образцов рака и линии раковых клеток из нескольких органов, что свидетельствует о широкой применимости. Он может быть использован для выявления рака стволовых клеточных биомаркеров, экран фармацевтических препаратов ориентации рака стволовых клеток, и обнаружить новые терапевтические цели в раковых заболеваниях.

Первичные нормальные клетки эпителия простаты человека помещаются в фибронектин покрытием культуры блюда и рост клеток поддерживается в 2D культуры(Рисунок 1a). При переходе в 3D-культуру с мембранной матрицей подвала дифференцированные эпителиальные клетки ме...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Используя первичные эпителиальные клетки простаты человека, мы сообщаем о новом методе, свободном от биомаркеров функциональной характеристики стволовых клеток, спомощьив сфероидной этикетке- удержания. Пошаговым протоколом описывается для маркировки 2D, CFSE или Far Red 2D-клеток; трехмерное образование сфероидов; маркировка удерживающей стволовые клетки идентификации иммуноцитохимии; и изоляция от FACS.

Изоляция стволовых клеток от трехмерных сфероидных культур

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Изоляция стволовых клеток остается серьезной проблемой из-за совместной изоляции клеток-предшественников с использованием современных методов. Мы разработали новый анализ без биомаркеров, чтобы изолировать тихие стволовые клетки от смешанных прародителей. Основным преимуществом этого сфероида основе, этикетки удержания анализа, он может расширить и изолировать живые стволовые клетки от своих дочерей прародителей FACS с помощью CFSE или Far Red маркировки.В то время как обычные методы лечения искоренить большинство раковых клеток простаты, раковые стволовые клетки остаются из-за терапевтической устойчивости, тем самым вождения прогрессирования заболевания. Изоляция стволовых клеток позволит идентифицировать новые гены, которые могут быть терапевтически совместно направлены на эффективную ремиссию болезни. Наш анализ удержания этикетки применим для нормальной изоляции стволовых клеток от различных тканей и клеток, а также для исследования раковых стволовых клеток.Важно отметить, что этот анализ применим к другим эпителиальным ракам клеток, таким как рак молочной железы и колоректального рака. Начните с покрытия 100-миллиметровых культур блюд с двумя миллилитров 2,5 микрограмма фибронектина раствора и инкубировать их на ночь при комнатной температуре. Затем аспирировать раствор и дайте культуре блюда высохнуть в шкафу биобезопасности в течение 45 минут.Добавьте девять миллилитров эпителиальной среды роста клеток простаты в блюдо с фибронектином и держите его в тепле в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах Цельсия. Оттепель один флакон замороженных человеческих эпителиальных клеток простаты в 37 градусов по Цельсию водяной бане, и повторного перерасхода клеток в 10 миллилитров теплой среды. Центрифуга клеточной суспензии при 500 раз г в течение пяти минут.Затем аспирировать и отказаться от супернатанта. Перерасходовать клетки в один миллилитр теплой среды культуры и передать один миллилитр суспензии непосредственно на фибронектин покрытием блюдо с предварительно разогретой среде. Затем инкубировать блюдо в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию.При совместной маркировке клеток подготовьтесь к ячейкам, помеченным BrdU, в 10-дней 2D-культуре, как описано в текстовой рукописи. Затем добавьте пять микромолейных CFSE или Far Red и инкубировать клетки в течение 30 минут. После инкубации, тщательно аспирировать среды с красителем и мыть клетки дважды с пятью миллилитров теплого PBS.Далее выполните энзиматическое пищеварение с 05%трипсином ЭДТА в соответствии с рукописными указаниями. Центрифуга клетки на 500 раз g в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Клетки были повторно использованы в ледяной, один-к-одному подвале мембранной матрицы и культуры средней смеси для 3D-образования простасферы.Чтобы подготовить культуру простасферы в 3D-матрице подвальной матричной системы, оттаивать матрицу мембраны подвала при четырех градусах Цельсия на ночь и держать ее на льду перед использованием. Затем аккуратно добавьте один миллилитр ледяной мембранной матрицы в равный объем среды ледяной культуры. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать, заботясь, чтобы не ввести пузырьки воздуха.Resuspend пять раз от 10 до 1/4 человека простаты эпителиальных клеток в ледяной один-к-одному подвале мембраны матрицы и культуры сми смесь для общего объема 500 микролитров. Pipette решение нижней обода каждого хорошо и вихрем пластины равномерно распределить смесь. Поместите пластину в инкубатор двуокиси углерода 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы матрица затвердеет.Затем накройте его одним миллилитром теплой культуры среды на колодец, убедившись, что не беспокоить кольцо. Для сбора CFSE помечены prostaspheres заменить среды с двумя миллилитров dispase и пипетки вверх и вниз, чтобы смешать несколько раз. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут, чтобы переварить матрицу, а затем собрать смесь сферы в 15-миллилитровую центрифугу трубки.Центрифуга сфер на 500 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Перезагнул гранулы в 500 микролитров теплого 05%трипсина ЭДТА и перенесите их в 1,5-миллилитровую центрифугу. Инкубировать сферы при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут, затем добавить 500 микролитров теплого PBS с 10%FBS.Передайте их через одноми миллилитровый шприц с 26-калиберной иглой, чтобы полностью размежевать сферы. Центрифуга клетки на 500 раз g в течение пяти минут. Затем аспирировать и отказаться от супернатанта.Переподходить клетки в один миллилитр теплой среды культуры с одним микрограммом на миллилитр пропидия йодида, чтобы испачкать мертвые клетки и инкубировать их в течение одной минуты при комнатной температуре. Повторите центрифугу и выбросьте супернатант. Затем промойте клетки одним миллилитром теплой среды.Повторите центрифугу и выбросьте супернатант. Resuspend клетки в одном миллилитре теплой среды культуры и собирать клетки в пятими миллилитров полистирола круглые нижние трубки, фильтруя их через 35-микрон поры размер клетки ситечко оснастки шапки. Выполните FACS анализ трипсина-рассеянных клеток простасферы с маркировкой CFSE.Использование не помеченных ячеек в качестве отрицательного контроля и клеток с маркировкой CFSE в качестве положительного контроля для настройки ворот, запуска образца для сортировки и сбора субпопуляций дробных клеток CFSE-high и CFSE-low. Первичные нормальные эпителиальные клетки предстательной железы человека были помещены в фибронектин покрытием культуры блюда и рост клеток был сохранен в 2D культуры. После перехода в 3D культуру с мембранной матрицей подвала, дифференцированные эпителиальные клетки медленно вымерли, и остались только стволовые клетки простаты.Двойная маркировка эпителиальных клеток предстательной железы в 2D-культуре с последующим образованием сфероидов в 3D-культуре показала колокализацию BrdU, CFSE и Far Red в тех же клетках, сохраняющих этикетки. Двойной иммуностепенинг показал, что клетки, сохраняющие этикетки, обладают более низким уровнем цитокератина белка кератина 14, снижение клеточного соединения белка E-кадерина, увеличение стволовых клеток ранних маркерных белков Wnt10b и ALDH1A1, увеличение аутофагии белка LC3, и увеличение миозин IIB. Кроме того, анализ на основе сфероидов, удержания этикетки, успешно обнаруживает раковые стволовые клетки в образцах рака простаты.CFSE помечены сохранения стволовых раковых клеток и сфероидов, полученных из образцов рака предстательной железы человека выставлены снижение E-кадерин белка по сравнению с не помечены клетки-предшественники. При попытке этого протокола, важно поддерживать матрицу в жидкой форме для культуры средней подготовки. Храните его на ночь при четырех градусах, и охладить пипетки советы в ледяной PBS до дозирования матрицы.После изоляции стволовых клеток с использованием сфероидной основе этикетки удержания анализа, одноклеточной РНК секвенирования и протеомного анализа могут быть выполнены для выявления конкретных генов и новых биомаркеров в стволовых клетках. Изоляция живых раковых стволовых клеток с помощью анализа на основе меток на основе меток позволяет исследователям выращивать опухолевидные опухоли, полученные из раковых стволовых клеток, и проверять новые противоопухолявые препараты.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Создание рака стволовых клеточных культур от человека обычного остеосаркомы

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Подготовка и метаболических Assay 3-мерной сфероида Сопредседатель культур клеток поджелудочной железы и фибробластов

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Изоляция и характеристика опухолевых клеток от саркомы пациента полученных Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Изоляция эндотелиальных клеток человека от обычной толстой кишки и колоректальный рак - улучшение протокол

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Убийство Assay сфероида клетками T автомобилей

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Подражая и манипулирования поджелудочной железы ацинарной протоковой метаплазии в 3-мерной клеточной культуре

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Оценка жизнеспособности и смерти клеток в 3D сфероидных культурах раковых клеток

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Открытие гена водителя в колоректальных HT29-производных рака стволовых как опухоли

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...