Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Agradecemos al Núcleo de Citometría de Flow de la Universidad de Illinois en Chicago por su ayuda en la clasificación de células.

Todas las preparaciones de manipulación celular y medios deben realizarse con técnica aséptica en un gabinete de seguridad biológica de clase II (BSC).
1. Cultivo y mantenimiento de células HPrEC en 2D
<ol><li>Recubrir platos de cultivo de 100 mm con 2 ml de solución de fibronectina de 2,5 g/cm2 durante la noche a temperatura ambiente (RT). Aspirar la solución y dejar que los platos de cultivo se sequen al aire en el BSC durante 45 minutos.</li>
	<li>Añadir 9 ml del medio ...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

La citometría de flujo utilizando múltiples marcadores de superficie de células madre es un enfoque comúnmente utilizado para la investigación de células madre a pesar de carecer de especificidad y selectividad1,5,6. Mientras que la formación de esferoides en un sistema de cultivo 3D es otro método útil para enriquecer la población rara de células madre de células epiteliales primarias, incluyendo HPrEC, los esferoid...

La glándula prostática humana contiene epitelio luminal con función secretora y células basales subyacentes junto con un componente inusual de la célula neuroendocrina. Las células epiteliales, en este caso, se generan a partir de una población rara de células madre prostáticas que están relativamente inactivas in vivo y actúan como un sistema de reparación para mantener la homeostasis glandular durante toda la vida1. A pesar de muchos avances, la identificación y el aislamiento funcional de las células madre prostáticas sigue siendo un desafío importante en el campo. Los biomarcadores de células madre, incluidas las metodologías basadas en marcadores de superficie celular combinadas con la citometría de flujo, se utilizan comúnmente para la investigación de células madre2,3,4. Sin embargo, los resultados de enriquecimiento y aislamiento varían ampliamente en función de las combinaciones de marcadores y la especificidad de los anticuerpos5,6, lo que plantea preguntas sobre la identidad de las células aisladas. Otro enfoque ampliamente utilizado para el enriquecimiento celular similar a un tallo es el cultivo esferoide tridimensional (3D)2,3,4. Mientras que las células madre residentes son relativamente indistinguen in vivo con restricciones de nicho, se someten a división celular en el cultivo de matriz 3D (tanto simétrica como asimétrica), generando células madre y progenitoras que se reproducen rápidamente hacia el compromiso de linaje7,8. Los esferoides formados son una mezcla heterogénea que contiene células madre y células progenitoras en varias etapas del compromiso de linaje, incluyendo células progenitoras en etapas tempranas y tardías. Por lo tanto, los ensayos que utilizan toda la esferoides no son exclusivos de las células madre, por lo que la identificación de propiedades únicas de células madre no es concluyente. Por lo tanto, es fundamental crear ensayos para identificar y separar las células madre de la próstata de sus progenitores hijas. Con este fin, el objetivo del protocolo actual es establecer un sistema de ensayo que permita la identificación y aislamiento eficiente de las células madre de los tejidos prostáticos humanos seguido de un sólido análisis aguas abajo de sus funciones biológicas.
La retención de etiquetas a largo plazo de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) es ampliamente utilizada para el seguimiento in vivo e in vitro del linaje de las células madre en función de su tiempo de duplicación prolongado9,10. El enfoque actual para la identificación y el aislamiento de células madre prostáticas descritos en este documento se basa en sus propiedades relativas de característica en reposo y retención de etiquetas dentro de una población epitelial mixta. Además, sobre la base de la hipótesis inmortal del ADN de la hebra, sólo las células madre pueden someterse a la división celular asimétrica. La célula madre representa la célula hija que contiene el ADN parental más antiguo, mientras que la célula progenitora, que es una célula hija comprometida, recibe el ADN recién sintetizado. La propiedad única de células madre descrita anteriormente se explota para realizar el etiquetado BrdU en células madre parentales en cultivos primarios y luego rastrear su etiqueta después de BrdU-washout tras la transferencia al cultivo esferoide sin anclaje 3D. Mientras que la mayoría de las células epiteliales primarias de próstata conservan un fenotipo ampollador basal y de tránsito en el cultivo 2D, también hay una población rara de células madre multipotentes que reponen y mantienen la homeostasis epitelial como lo demuestra la formación de esferoides o organoides totalmente diferenciados con los medios de cultivo correspondientes al transferirlo a los sistemas 3D3,12. En nuestro protocolo actual, mediante el uso de esferoides prostíferos HPrEC o ensayos de retención BrdU, CFSE o Far Red basados en prostafera seguidos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), identificamos células madre retenedoras de etiquetas en esferoides en un solo nivel de célula13.
Es importante destacar que confirmamos además las características de las células madre de las células que retienen etiquetas dentro de los esferoides en etapa temprana en comparación con las células progenitoras con compromiso de linaje. Estos incluyen división asimétrica de células madre, capacidad de formación de esferoides in vitro y capacidad de regeneración de tejido in vivo, actividad elevada de la autofagia, biogénesis ribosoma aumentada y disminución de la actividad metabólica. Posteriormente, se realizó el análisis de ARNseq. Se observaron genes expresados diferencialmente en células esferoides que conservan etiquetas que pueden servir como nuevos biomarcadores para células madre de próstata humanas. Este enfoque de retención de etiquetas basado en esferoides puede aplicarse a las muestras de cáncer para identificar de manera similar a un pequeño número de células similares a los tallos de cáncer, proporcionando así oportunidades traslacionales para manejar las poblaciones resistentes terapéuticas13. A continuación se presenta el ensayo de retención de etiquetas basado en prostasfera utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas (HPrEC) como ejemplo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

A pesar de los avances en la investigación con células madre adultas, la identificación y el aislamiento de células madre de muestras de tejido sigue siendo un desafío importante. Mientras que las células madre residentes están relativamente inactivas con restricciones de nicho en los tejidos adultos, entran en el ciclo celular en cultivo tridimensional (3D) libre de anclaje y se someten a división celular simétrica y asimétrica, dando lugar tanto al tallo como al progenitor Células. Estos últimos proliferan rápidamente y son la principal población celular en varias etapas del compromiso de linaje, formando esferoides heterogéneos. Usando células epiteliales humanas normales primarias (HPrEC), se desarrolló un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides que permite la identificación y el aislamiento funcional de las células madre que inician los esferoides a una sola resolución celular.
HPrEC o líneas celulares se cultivan bidimensionalmente (2D) con BrdU durante 10 días para permitir su incorporación al ADN de todas las células divisorias, incluidas las células madre auto-renuevas. El lavado comienza tras la transferencia al cultivo 3D durante 5 días, durante los cuales las células madre se autonuevan a través de la división asimétrica e inician la formación de esferoides. Mientras que las células madre hijas relativamente inactivas conservan el ADN parental etiquetado por BrdU, los progenitores hijas proliferan rápidamente, perdiendo la etiqueta BrdU. BrdU se puede sustituir por CFSE o Far Red pro-dyes, que permiten el aislamiento de células madre vivas por FACS. Las características de las células madre se confirman mediante la formación de esferoides in vitro, ensayos de regeneración de tejido in vivo y la documentación de sus divisiones celulares simétricas/asimétricas. Las células madre aisladas que retienen etiquetas pueden ser interrogadas rigurosamente por estudios moleculares y biológicos aguas abajo, incluyendo ARN-seq, ChIP-seq, captura de células únicas, actividad metabólica, perfilado de proteome, inmunocitoquímica, formación de organoides y regeneración de tejido in vivo. Es importante destacar que este enfoque de aislamiento funcional de células madre sin marcadores identifica células similares a los tallos de muestras de cáncer fresco y líneas celulares cancerosas de múltiples órganos, lo que sugiere una amplia aplicabilidad. Se puede utilizar para identificar biomarcadores celulares similares a los tallos del cáncer, productos farmacéuticos de la pantalla dirigidos a células similares a los tallos del cáncer, y descubrir nuevas dianas terapéuticas en los cánceres.

Las células epiteliales humanas normales primarias se colocan en platos de cultivo recubiertos de fibronectina y el crecimiento celular se mantiene en el cultivo 2D(Figura 1a). Tras la transferencia al cultivo 3D con una matriz de membrana de sótano, las células epiteliales diferenciadas mueren lentamente. Sólo las células madre de próstata pueden sobrevivir en un cultivo libre de anclas y formar esferoides en 5 días(Figura 1b</st...

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Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Utilizando células epiteliales de próstata primarias humanas, informamos de un nuevo método libre de biomarcadores de caracterización funcional de células similares a tallos mediante un ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides. Se describe un protocolo paso a paso para el etiquetado de celdas 2D BrdU, CFSE o Far Red; formación de esferoides tridimensionales; identificación celular similar a un tallo que retiene la etiqueta por inmunocitoquímica; y aislamiento por FACS.

Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

El aislamiento de células madre sigue siendo un desafío importante debido al coaislado de las células progenitoras utilizando métodos actuales. Desarrollamos un nuevo ensayo libre de biomarcadores para aislar las células madre en reposo de los progenitores mixtos. La principal ventaja de este ensayo basado en esferoides, retención de etiquetas, puede expandir y aislar las células madre vivas de sus progenitores hija por FACS utilizando el etiquetado CFSE o Far Red.Mientras que las terapias convencionales erradican la mayoría de las células cancerosas de próstata, las células madre cancerosas permanecen debido a la resistencia terapéutica, impulsando así la progresión de la enfermedad. El aislamiento celular similar a un tallo permitirá la identificación de genes novedosos que pueden ser co-dirigidos terapéuticamente para la remisión efectiva de la enfermedad. Nuestro ensayo de retención de etiquetas es aplicable para el aislamiento normal de células madre de varios tejidos y células, y para la investigación de células madre cancerosas.Es importante destacar que este ensayo es aplicable a otros cánceres de células epiteliales, como los cánceres de mama y colorrectales. Comience por recubrir platos de cultivo de 100 milímetros con dos mililitros de solución de fibronectina de 2,5 microgramos e incubarlos durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, aspirar la solución y dejar que los platos de cultivo se sequen al aire en el gabinete de bioseguridad durante 45 minutos.Agregue nueve mililitros del medio de crecimiento de células epiteliales de próstata a un plato recubierto de fibronectina y manténgalo caliente en la incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Descongelar un vial de células epiteliales de próstata humanas congeladas en un baño de agua de 37 grados Celsius, y resuspender las células en 10 mililitros de medio caliente. Centrifugar la suspensión celular a 500 g durante cinco minutos.A continuación, aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de medio de cultivo caliente y transferir un mililitro de la suspensión directamente al plato recubierto de fibronectina con el medio precalegado. Luego incubar el plato en la incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.Si co-etiqueta las celdas, prepare las celdas etiquetadas con BrdU en una referencia 2D de 10 días como se describe en el manuscrito del texto. Luego agregue cinco micromolares CFSE o Far Red e incubar las células durante 30 minutos. Después de la incubación, aspira cuidadosamente el medio con el tinte y lavar las células dos veces con cinco mililitros de PBS caliente.A continuación, realice la digestión enzimática con 05%trypsin EDTA de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Las células se resuspendieron en matriz de membrana de sótano, uno a uno, fría y mezcla media de cultivo para la formación de prostasfera 3D.Para preparar el cultivo de la prostasfera en un sistema de matriz de sótano 3D, descongele la matriz de membrana del sótano a cuatro grados centígrados durante la noche y manténgala en hielo antes de usarla. A continuación, agregue suavemente un mililitro de matriz de membrana sótano helada en un volumen igual de medio de cultivo helado. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.Resuspender cinco veces 10 a 1/4 células epiteliales de próstata humana en matriz de membrana sótano frío en hielo y mezcla de medios de cultivo para un volumen total de 500 microlitros. Pipetear la solución al borde inferior de cada pozo y girar la placa para distribuir uniformemente la mezcla. Coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius durante 30 minutos para permitir que la matriz se solidifique.A continuación, cúbralo con un mililitro de medio de cultivo caliente por pozo, asegurándose de no molestar el anillo. Para cosechar las prostasferas etiquetadas por CFSE, sustituya el medio por dos mililitros dispase y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar varias veces. Incubar la placa a 37 grados celsius durante 30 minutos para digerir la matriz, luego recoger la mezcla de la esfera en un tubo centrífugo de 15 mililitros.Centrifugar las esferas a 500 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 500 microlitros de EDTA caliente 05%trypsin, y transferirlos a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Incubar las esferas a 37 grados Celsius durante cinco minutos, luego añadir 500 microlitros de PBS caliente con 10%FBS.Pasarlos a través de una jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 26 para disociar completamente las esferas. Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos. A continuación, aspirar y desechar el sobrenadante.Resuspender las células en un mililitro de medio de cultivo cálido con un microgramo por yoduro propidium mililitro para manchar las células muertas e incubarlas durante un minuto a temperatura ambiente. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Luego lave las células con un mililitro de medio caliente.Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de medio de cultivo caliente y recoger las células en tubos inferiores redondos de poliestireno de cinco mililitros filtrándolas a través de tapas de presión de colador de células de tamaño de poro de 35 micras. Realice análisis FACS de células prostráesferas dispersas por CFSE dispersas por trippsina.Usando celdas no etiquetadas como control negativo y celdas etiquetadas con CFSE como un control positivo para establecer las puertas, ejecute la muestra para ordenar y recoger las subpoblaciones de celdas fraccionadas CFSE-alta y CFSE-baja. Las células epiteliales de próstata humanas normales primarias se colocaron en platos de cultivo recubiertos de fibronectina y el crecimiento celular se mantuvo en el cultivo 2D. Tras la transferencia a un cultivo 3D con una matriz de membrana sótano, las células epiteliales diferenciadas se extinguieron lentamente y sólo quedaron las células madre de la próstata.El etiquetado doble de las células epiteliales de próstata en el cultivo 2D seguido de la formación de esferoides en el cultivo 3D mostró la colocación de BrdU, CFSE y Far Red en las mismas células que retienen la etiqueta. La inmunostaining dual mostró que las células retenidas de etiquetas presentan niveles más bajos de proteína de citoqueratina queratina 14, disminución de la proteína de unión celular E-cadherina, aumento de las proteínas marcadoras tempranas de células madre Wnt10b y ALDH1A1, aumento de la proteína de autofagia LC3, y aumento de la miosina IIB. Además, el ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides detecta con éxito células similares al cáncer en muestras de cáncer de próstata.Las células cancerosas y esferoides similares a la proaño con etiqueta CFSE derivados de muestras de cáncer de próstata humanos mostraron una proteína E-cadherina reducida en relación con las células progenitoras no etiquetadas. Al intentar este protocolo, es importante mantener la matriz en forma líquida para la preparación de medios de cultivo. Guárdelo durante la noche a cuatro grados, y enfríe las puntas de la pipeta en PBS helada antes de la matriz de dosificación.Tras el aislamiento de las células madre utilizando el ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides, se puede realizar la secuenciación de ARN de una sola célula y el análisis proteómico para identificar genes específicos y nuevos biomarcadores en células madre. El aislamiento de las células madre cancerosas vivas mediante el ensayo de retención de etiquetas basado en esferoides permite a los investigadores cultivar tumoresoides derivados de células madre de cáncer in vitro y detectar nuevos fármacos contra el cáncer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Establecimiento de Cultivos Celulares del Cáncer Humano de osteosarcoma convencional Tallo

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Preparación y análisis metabólico de 3 dimensiones del esferoide co-cultivos de células de cáncer de páncreas y fibroblastos

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Aislamiento de células endoteliales humanas de Colon Normal y el Carcinoma colorrectal - un protocolo mejorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Imitando y manipulando Metaplasia pancreática Acinar Ductal en cultivo celular 3-dimensional

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Descubrimiento de genes conductores en tumores timos similares al cáncer de 29 años de origen colorrectal

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...