Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidrag från National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Vi tackar Flow Cytometry Core vid University of Illinois i Chicago för hjälp med cell sortering.

Alla cell hanterings-och medie preparat ska utföras med aseptisk teknik i ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II (BSC).
1. kultur och underhåll av HPrEC-celler i 2D
<ol><li>Coat 100 mm kultur rätter med 2 ml 2,5 μg/cm2 Fibronektin lösning över natten vid rumstemperatur (RT). Aspirera på lösningen och låt kultur rätterna lufttorka i BSC för 45 min. fibronectin-belagda kultur rätter kan förvaras 2 – 4 veckor vid 4 ° c.</li>
	<li>Tillsätt 9 mL av prostatan epitel...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

Flödescytometri med flera stamcells markörer är en vanlig metod för stamcellsforskning, trots att den saknar både specificitet och selektivitet1,5,6. Medan sfäroid formation i ett 3D-kultur system är en annan användbar metod för att berika den sällsynta stamceller befolkningen från primära epitelceller, inklusive hprec, de resulterande sfäroid är fortfarande en heterogen blandning av stamceller och stamfader celler...

Den mänskliga prostatakörteln innehåller luminala epitel med sekretoriska funktion och basal celler underliggande det tillsammans med en ovanlig neuroendokrina cell komponent. De epitelceller, i detta fall, genereras från en sällsynt population av prostata stamceller som är relativt quiescent in vivo och fungera som ett reparationssystem för att upprätthålla körtel homeostas hela livet1. Trots många framsteg är identifieringen och funktionell isolering av prostata stamceller fortfarande en stor utmaning på området. Stamcells biomarkörer, inklusive cellytmarkeringsbaserade metoder kombinerat med flödescytometri används ofta för stamcellsforskning2,3,4. Resultaten för berikning och isolering varierar dock mycket som en funktion av markör kombinationer och antikropps specificitet5,6, vilket väcker frågor om de isolerade cellernas identitet. En annan allmänt använd metod för stamliknande cell berikning är tredimensionell (3D) sfäroid kultur2,3,4. Medan inhemska stamceller är relativt quiescent in vivo med nisch begränsningar, de genomgår celldelning i 3D Matrix kultur (både symmetriska och asymmetriska), genererar både stamceller och progenitorceller som snabbt föröka sig mot härstamnings åtagandet7,8. De bildade sfäoiderna är en heterogen blandning som innehåller både stamceller och progenitorceller i olika stadier av härstamnings åtagande, inklusive tidiga och sena Stadium stamceller. Således, analyser med hjälp av hela spheroids är inte stamcells exklusiva, vilket gör identifieringen av unika stamceller egenskaper ofullständiga. Därför är det viktigt att skapa analyser för att identifiera och separera stamceller från deras dotter progenitorer. I detta syfte är målet med det nuvarande protokollet att upprätta ett analyssystem som möjliggör effektiv identifiering och isolering av stamceller från mänskliga prostata vävnader följt av en robust analys av deras biologiska funktioner i senare led.
Långsiktig 5-Bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) etikett-retention används ofta för in vivo och in vitro-linjen spårning av stamceller baserat på deras förlängda fördubblings tid9,10. Den nuvarande metoden för identifiering och isolering av prostata stamceller är baserad på deras relativa quiescent karakteristiska och etikett-retention egenskaper inom en blandad epitelial population. Dessutom, baserat på den odödliga strand DNA-hypotesen, kan endast stamceller genomgå asymmetrisk celldelning. Stamcellen representerar den dotter cell som innehåller den äldre föräldra-DNA medan stamcells cellen, som är en engagerad dotter cell, tar emot den nyligen syntetiserade DNA. Den unika stamcells egendom som beskrivs ovan utnyttjas för att utföra BrdU märkning i föräldra stamceller i primära kulturer och sedan spåra deras etikett efter BrdU-washout vid överföring till 3D ankare-fri sfäroid kultur. Medan majoriteten av primära prostata epitelceller behålla en basal och transit förstärkning fenotyp i 2D-kultur, det finns också en sällsynt population av multipotenta stamceller påfyllning och bibehålla epitelial homeostas som framgår av bildandet av sfätrooider eller helt differentierade organoider med motsvarande kultur media vid överföring till 3D-system3,12. I vårt nuvarande protokoll, genom att använda hprec prostata spheroids eller prostasphere-baserade BrdU, cfse, eller far Red retention analyser följt av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), identifierar vi etikett-behålla stamceller i spheroids på en enda cellnivå13.
Viktigt, vi bekräftade ytterligare stamcells egenskaperna hos etikett-behålla celler inom tidigt skede spheroids jämfört med stamceller med härstamning engagemang. Dessa inkluderar stamceller asymmetrisk Division, in vitro-sfäroid formation förmåga och in vivo vävnad regenereringskapacitet, förhöjd autofagi aktivitet, förstärkt ribosombiogenes och minskad metabolisk aktivitet. Därefter utfördes RNAseq-analys. Differentiellt uttryckt gener i etikett-behålla sfäroid celler observerades som kan fungera som nya biomarkörer för mänskliga prostata stamceller. Detta spheroid-baserade etikett-behålla tillvägagångssätt kan gälla för cancer preparat att på liknande sätt identifiera ett litet antal cancer Stem-liknande celler, vilket ger translationella möjligheter att hantera de terapeutiska resistenta populationer13. Presenteras nedan är prostasphere-baserade etikett-retention analys med hjälp av mänskliga primära prostataepitelceller (HPrEC) som ett exempel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

Trots framsteg inom forskning om adulta stamceller är identifiering och isolering av stamceller från vävnadsprov fortfarande en stor utmaning. Medan inhemska stamceller är relativt quiescent med nisch begränsningar i vuxna vävnader, de går in i cellcykeln i ankare-fri tredimensionell (3D) kultur och genomgår både symmetriska och asymmetriska celldelning, vilket ger upphov till både Stem och stamcells Celler. Den senare sprider sig snabbt och är den stora cellpopulationen i olika stadier av härstamnings åtagande, som bildar heterogena spheroids. Med hjälp av primära normala mänskliga prostataepitelceller (HPrEC), en spheroid-baserade, etikett-retention assay utvecklades som möjliggör identifiering och funktionell isolering av sfäroid-initiera stamceller vid en enda cell upplösning.
HPrEC eller cellinjer är två-dimensionellt (2D) odlade med BrdU i 10 dagar för att tillåta dess införlivande i DNA av alla delnings celler, inklusive självförnyande stamceller. Tvätta ur inleds vid överföring till 3D-kulturen i 5 dagar, under vilken stamceller själv förnya genom asymmetrisk Division och initiera sfäroid formation. Medan relativt quiescent dotter stamceller behåller BrdU-märkt föräldra-DNA, dotter föräldraparets snabbt förökat, förlorar BrdU etiketten. BrdU kan ersättas med CFSE eller långt rött Pro-färgämnen, som tillåter levande stamcells isolering av FACS. Stamcells egenskaper bekräftas av in vitro-sfäroid formation, in vivo vävnad förnyelse analyser, och genom att dokumentera deras symmetriska/asymmetriska cell divisioner. Den isolerade etikett-behålla stamceller kan noggrant förhöras av nedströms molekylära och biologiska studier, inklusive RNA-SEQ, ChIP-SEQ, Single cell Capture, metabolisk aktivitet, proteomet profilering, immunocytokemi, Organoid formation, och in vivo vävnad förnyelse. Viktigt, denna markör-fri funktionell stamcells isolering metod identifierar Stem-liknande celler från färska cancer preparat och cancer cellinjer från flera organ, vilket tyder på bred tillämplighet. Det kan användas för att identifiera cancer Stem-liknande cell biomarkörer, Screen Pharmaceuticals inriktning cancer Stem-liknande celler, och upptäcka nya terapeutiska mål i cancer.

Primära normala humana prostataepitelceller placeras i fibronectin-belagda kultur rätter och celltillväxt upprätthålls i 2D-kultur (figur 1a). Vid överföring till 3D-kultur med en basalmembran matris, differentierade epitelceller sakta dö ut. Endast prostata stamceller kan överleva i en ankare-fri kultur och bilda spheroids i 5 dagar (figur 1b).
Dubbel märkning av prostata epitelceller i 2D-...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Med hjälp av mänskliga primära prostataepitelceller, rapporterar vi en ny biomarker-fri metod för funktionell karakterisering av stamceller med en sfäroid-baserade etikett-retention assay. Ett steg-för-steg-protokoll beskrivs för BrdU, CFSE eller långt röd 2D-cellmärkning; tredimensionell sfäroid formation; etikett-behålla Stem-liknande cell identifiering av immunocytochemistry; och isolering av FACS.

Isolering av Stem-liknande celler från 3-dimensionella sfäroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Stamcellsisolering är fortfarande en stor utmaning på grund av samisolering av stamceller med nuvarande metoder. Vi utvecklade en ny biomarkörfri analys för att isolera quiescent stamceller från blandade stamfader. Den största fördelen med denna sfäroid-baserade, etikett-retention assay, det kan expandera och isolera levande stamceller från deras dotter progenitors av FACS använder CFSE eller Far Red märkning.Medan konventionella terapier utrota de flesta prostatacancerceller, cancerceller kvar på grund av terapeutisk resistens, vilket driver sjukdomsprogression. Stamliknande cellisolering kommer att tillåta identifiering av nya gener som terapeutiskt kan vara medinriktade för effektiv sjukdomsremission. Vår etikett-retention assay är tillämpliga för normal stamcellsisolering från olika vävnader och celler, och för cancer stamcellsforskning.Viktigt, denna assay är tillämplig på andra epitelial cell cancer, såsom bröst och kolorektal cancer. Börja med beläggning 100-millimeters kultur rätter med två milliliter av 2,5 mikrogram fibronectin lösning och inkubera dem över natten vid rumstemperatur. Aspirera sedan lösningen och låt kulturdiskarna lufttorka i biosäkerhetsskåpet i 45 minuter.Tillsätt nio milliliter av prostataepitelcelltillväxtmediet till en fibronectinbelagd skål och håll den varm i koldioxidinkubatorn vid 37 grader Celsius. Tina en flaska frysta mänskliga prostata epitelceller i en 37 grader Celsius vattenbad, och återanvända cellerna i 10 milliliter varmt medium. Centrifugera cellupphängningen vid 500 gånger g i fem minuter.Därefter aspirera och kassera supernatanten. Resuspend cellerna i en milliliter av varmt odlingsmedium och överföra en milliliter av suspensionen direkt till fibronectin-belagda skålen med förvättnad medium. Sedan inkubera skålen i koldioxidinkubatorn vid 37 grader Celsius.Om co-labeling cellerna, förbereda BrdU-märkta celler i 10-dagar 2D kultur som beskrivs i texten manuskriptet. Tillsätt sedan fem mikromolar CFSE eller Far Red och inkubera cellerna i 30 minuter. Efter inkubationen aspirera försiktigt mediet med färgämnet och tvätta cellerna två gånger med fem milliliter varm PBS.Därefter utför enzymatisk matsmältning med 05%trypsin EDTA enligt manuskriptet riktningar. Centrifugera cellerna vid 500 gånger g i fem minuter och kassera supernatanten. Celler var resuspended i iskall, en-till-en källare membran matris och kultur medium mix för 3D prostasphere bildning.För att förbereda prostasphere kultur i en 3D källare matrissystem, tina källaren membranmatris vid fyra grader Celsius över natten och hålla den på is före användning. Tillsätt sedan försiktigt en milliliter iskall källarmembranmatris till en lika stor volym iskallt odlingsmedium. Pipett upp och ner för att blanda, var noga med att inte införa luftbubblor.Resuspend fem gånger 10 till 1/4 mänskliga prostata epitelceller i iskall en-till-en källare membran matris och kultur media mix för total volym av 500 mikroliter. Pipettera lösningen till bottenfälgen på varje brunn och snurra plattan för att jämnt fördela blandningen. Placera plattan i en 37 grader Celsius koldioxidinkubator i 30 minuter så att matrisen att stelna.Sedan täcka den med en milliliter varm odling medium per brunn, se till att inte störa ringen. För att skörda de CFSE-märkta prostasfärerna byt ut mediet med två milliliter dispase och pipetter upp och ner för att blanda flera gånger. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i 30 minuter för att smälta matrisen, samla sedan sfärblandningen i ett 15-milliliter centrifugrör.Centrifugera sfärerna vid 500 gånger g i fem minuter och kassera supernatanten. Resuspend pelleten i 500 mikroliter av varma 05%trypsin EDTA, och överföra dem till en 1,5-milliliter centrifugera röret. Inkubera sfärerna i 37 grader Celsius i fem minuter, tillsätt sedan 500 mikroliter av varma PBS med 10%FBS.För dem genom en en milliliter spruta med en 26-gauge nål för att helt ta avstånd från sfärerna. Centrifugera cellerna vid 500 gånger g i fem minuter. Därefter aspirera och kassera supernatanten.Resuspend cellerna i en milliliter av varmt odlingsmedium med ett mikrogram per milliliter propidium iodid att färga de döda cellerna och inkubera dem i en minut vid rumstemperatur. Upprepa centrifugeringen och kassera supernatanten. Tvätta sedan cellerna med en milliliter varmt medium.Upprepa centrifugeringen och kassera supernatanten. Resuspend cellerna i en milliliter av varmt odlingsmedium och samla cellerna i fem-milliliter polystyren runda bottenrör genom att filtrera dem genom 35-micron porstorlek cell sil snap caps. Utför FACS-analys av trypsin-spridda CFSE-märkta prostasfärceller.Använda icke-märkta celler som en negativ kontroll och CFSE-märkta celler som en positiv kontroll för att ställa in grindarna, kör provet för att sortera och samla in subpopulationerna av fraktionerade CFSE-hög och CFSE-låg celler. Primära normala mänskliga prostata epitelial celler placerades i fibronectin-belagda kultur rätter och celltillväxt bibehölls i 2D-kultur. Vid överföring till en 3D-kultur med en källare membran matris, differentierade epitelceller dog långsamt ut och endast prostata stamceller kvar.Dual-märkning av prostata epitelial celler i 2D-kultur följt av sfäroid bildas i 3D-kultur visade colocalization av BrdU, CFSE och Far Red i samma etikett-behåll celler. Dubbla immunostaining visade att etikett-behålla celler uppvisar lägre nivåer av cytokeratin protein keratin 14, minskade cell junction protein E-kadherin, ökad stamceller tidiga markör proteiner Wnt10b och ALDH1A1, ökad autofagi protein LC3 och ökade myosin IIB. Dessutom, den sfäroid-baserade, etikett-retention analys upptäcker framgångsrikt cancer stamceller liknande celler i prostatacancer exemplar.CFSE-märkt behåller stamceller som cancerceller och sfäroider som härrör från mänskliga prostatacancer exemplar uppvisade minskad E-kadherin protein i förhållande till de icke-märkta stamceller celler. Vid försök detta protokoll, är det viktigt att upprätthålla matris i flytande form för odling medium beredning. Förvara den över natten i fyra grader, och chill pipett tips i iskall PBS före dispensering matris.Efter isolering av stamceller med hjälp av den sfäroidbaserade label-retention-analysen kan encellig RNA-sekvensering och proteomisk analys utföras för att identifiera specifika gener och nya biomarkörer i stamceller. Isolering av levande cancerceller av sfäroid-baserade etikett-retention analys gör det möjligt för forskare att odla cancer stamceller-härledda tumoroids in vitro och att skärmen nya anti-cancer läkemedel.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Etablering av cancerstamcellskulturer från Human Konventionell osteosarkom

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Förberedelse och metabola haltbestämning av 3-dimensionell sfäroid samtidig kulturer av pankreascancer celler och fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering av mänskliga Endothelial celler från Normal kolon och kolorektal carcinom - ett förbättrat protokoll

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Härma och manipulera bukspottskörteln Acinar-till-duktal metaplasi i 3-dimensionell cellodling

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Bedömning cell livs kraft och död i 3D Sfäroiden kulturer av cancer celler

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Upptäckten av driver gener i kolorektal HT29-härledda Cancer Stem-liknande tumorspheres

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...