Name: isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Kanser Enstitüsü R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH) hibeleri ile desteklenmiştir. Biz hücre sıralama konusunda yardım için Chicago Illinois Üniversitesi'nde Akış Sitometri Çekirdek teşekkür ederiz.

Tüm hücre kullanımı ve ortam preparatları Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde (BSC) aseptik teknikle yapılmalıdır.
1. 2D HPrEC Hücrelerinin Kültürü ve Bakımı
<ol><li>Oda sıcaklığında (RT) 2 mL 2,5 g/cm2 fibronectin çözeltisi ile 100 mm kültür yemekleri. Çözeltiyi aspire edin ve bsc'de 45 dk. Fibronektin kaplı kültür yemekleri 4 °C'de 2-4 hafta saklanabilir.</li>
	<li>100 mm'lik fibronektin kaplı bir kültür kabına prostat epitel hücresi büyüm...

<ol>
	<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+from+a+single+cell.">Generation of a prostate from a single cell.</a> Nature. 456, 804-808 (2008).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-initiated+transformation+of+prostate+epithelium+derived+from+normal+human+prostate+stem-progenitor+cells.">Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells.</a> Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).</li><li>Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+endocrine+disrupting+chemicals+on+human+prostate+stem/progenitor+cells+and+prostate+cancer+risk.">Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 65, 10946-10951 (2005).</li><li>Vander Griend, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CD133+in+normal+human+prostate+stem+cells+and+malignant+cancer-initiating+cells.">The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells.</a> Cancer Research. 68, 9703-9711 (2008).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetrical+and+asymmetrical+division+analysis+provides+evidence+for+a+hierarchy+of+prostate+epithelial+cell+lineages.">Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages.</a> Nature Communications. 5, 4758 (2014).</li><li>Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dividing+cellular+asymmetry:+asymmetric+cell+division+and+its+implications+for+stem+cells+and+cancer.">Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer.</a> Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).</li><li>Cicalese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+p53+regulates+polarity+of+self-renewing+divisions+in+mammary+stem+cells.">The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells.</a> Cell. 138, 1083-1095 (2009).</li><li>Klein, A. M., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+patterns+of+stem+cell+fate+in+cycling+adult+tissues.">Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues.</a> Development. 138, 3103-3111 (2011).</li><li>Cairns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+selection+and+the+natural+history+of+cancer.">Mutation selection and the natural history of cancer.</a> Nature. 255, 197-200 (1975).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159, 163-175 (2014).</li><li>Hu, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+interrogation+of+adult+human+prostate+epithelial+cells+at+single+cell+resolution.">Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution.</a> Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).</li><li>Bryant, D. M., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+E-cadherin+trafficking.">The ins and outs of E-cadherin trafficking.</a> Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).</li><li>Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+signaling.+An+integral+program+for+tissue+renewal+and+regeneration:+Wnt+signaling+and+stem+cell+control.">Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control.</a> Science. 346, 1248012 (2014).</li><li>Madueke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+WNT10B+in+normal+prostate+gland+development+and+prostate+cancer.">The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer.</a> The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9, 830-849 (2013).</li></ol>

Birden fazla kök hücre yüzey belirteçleri kullanarak Akış sitometrisi hem özgüllük ve seçicilik1,5,6eksik rağmen kök hücre araştırmaları için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Bir 3D kültür sisteminde küresel oluşumu birincil epitel hücrelerinden nadir kök hücre popülasyonunu zenginleştirmede başka yararlı bir yöntem iken, HPrEC dahil, ortaya çıkan sferoidler hala kök ve progenitor h?...

İnsan prostat bezi salgı fonksiyonu ve bazal hücreleri alışılmadık bir nöroendokrin hücre bileşeni ile birlikte altında yatan luminal epitel içerir. Epitel hücreleri, Bu durumda, vivo nispeten quiescent prostat kök hücrelerinin nadir bir popülasyondan oluşturulur ve yaşam boyunca glandüler homeostaz korumak için bir onarım sistemi olarak hareket1. Birçok ilerlemeye rağmen, prostat kök hücrelerinin tanımlanması ve fonksiyonel izolasyonu bu alanda önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Kök hücre biyobelirteçleri, akış sitometrisi ile birlikte hücre yüzeyi marker tabanlı metodolojiler de dahil olmak üzere yaygın kök hücre araştırma 2içinkullanılır2,3,4. Ancak, zenginleştirme ve izolasyon sonuçları marker kombinasyonları ve antikor özgüllüğü bir fonksiyonu olarak büyük ölçüde değişir5,6, izole hücrelerin kimliği hakkında sorular yükselterek. Kök benzeri hücre zenginleştirme için başka bir yaygın olarak kullanılan yaklaşım üç boyutlu (3D) küresel kültür2,3,4. Yerleşik kök hücreler niş kısıtlamalar ile vivo nispeten quiescent iken, onlar 3D matris kültüründe hücre bölünmesi geçmesi (hem simetrik ve asimetrik), hızla soy taahhüdü doğru çoğaltmak hem kök ve progenitor hücreleri üreten7,8. Oluşan küresel oidler, erken ve geç evre progenitor hücreleri de dahil olmak üzere, soy bağlılığının çeşitli aşamalarında hem kök hücreleri hem de progenitor hücreleri içeren heterojen bir karışımdır. Böylece, tüm küreseloidler kullanarak tahliller kök hücre özel değildir, benzersiz kök hücre özelliklerinin belirlenmesi sonuçsuz hale. Bu nedenle, kız larının atalarından prostat kök hücrelerini tanımlamak ve ayırmak için tahliller oluşturmak çok önemlidir. Bu doğrultuda, mevcut protokolün amacı, insan prostat dokularından kök hücrelerin etkin bir şekilde tanımlanmasıve izole edilmesine ve ardından biyolojik fonksiyonlarının sağlam downstream analizine olanak sağlayan bir tahlil sistemi kurmaktır.
Uzun süreli 5-bromo-2'-deoksiürinin (BrdU) etiket tutma yaygın olarak in vivo ve in vitro soy onların uzun katlama süresi 9 dayalı kök hücrelerin izlenmesi için kullanılır9,10. Burada tanımlanan prostat kök hücre tanımlama ve izolasyonu için mevcut yaklaşım, karışık epitel popülasyondaki göreceli kuskus karakteristiklerine ve etiket tutma özelliklerine dayanmaktadır. Ayrıca, ölümsüz iplikçik DNA hipotezine dayanarak, sadece kök hücreler asimetrik hücre bölünmesi geçirebilir. Kök hücre, büyük ebeveyn DNA'sını içeren kız hücresini temsil ederken, kendini adamış bir kız hücresi olan ata hücresi yeni sentezlenen DNA'yı alır. Yukarıda açıklanan benzersiz kök hücre özelliği birincil kültürlerde ebeveyn kök hücrelerinde BrdU etiketleme gerçekleştirmek ve daha sonra 3D çapa ücretsiz küresel kültüre transfer üzerine BrdU-washout aşağıdaki etiket izlemek için istismar edilir. Primer prostat epitel hücrelerinin çoğunluğu 2D kültürde bazal ve transit yükseltici fenotip korurken, aynı zamanda multipotent kök hücrelerin nadir bir popülasyon ulaştırır ve epitel homeostazı korumak gibi sferoidler veya 3Dsistemleretransferi üzerine ilgili kültür medya ile tam farklılaşmış organoidler oluşumu ile kanıtlandı12. Mevcut protokolümüzde, HPrEC prostat küreseloidleri veya prostasphere tabanlı BrdU, CFSE veya Uzak Kırmızı retansiyon testlerini ve ardından floresan aktif hücre sıralamasını (FACS) kullanarak, tek bir hücre düzeyinde sferoidlerde etiket tutucu kök hücreleri tanımlıyoruz13.
Daha da önemlisi, erken evre küresel hücrelerdeki etiket tutucu hücrelerin kök hücre özelliklerini soy taahhüdü ne göre daha da doğruladık. Bunlar arasında kök hücre asimetrik bölünmesi, in vitro küresel formasyon yeteneği ve in vivo doku rejenerasyon kapasitesi, yüksek otofaji aktivitesi, artırılmış ribozom biyogenezi ve azalmış metabolik aktivite sayılabilir. Daha sonra RNAseq analizi yapıldı. Etiket-istinat küresel hücrelerinde farklı olarak ifade edilen genlerin insan prostat kök hücreleri için yeni biyobelirteçler olarak hizmet edebileceği gözlenmiştir. Bu sheroid tabanlı etiket tutma yaklaşımı benzer kanser kök benzeri hücrelerin az sayıda belirlemek için kanser örnekleri için geçerli olabilir, böylece terapötik dirençli popülasyonları yönetmek için çeviri fırsatları sağlayan13. Aşağıda sunulan prostasphere tabanlı etiket tutma testi insan primer prostat epitel hücreleri kullanarak (HPrEC) bir örnek olarak.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringes</td>
			<td>Bectin Dickinson</td>
			<td>BD 309625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm culture dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm coverslips, sq</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284522</td>
			<td>For MatTek 35 mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 50 mm coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1.5 inch hypodermic needle</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1188826112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2N HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dish with cover glass bottom</td>
			<td>MatTek Corp</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>Glass bottom No. 0, uncoated, <img src="files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"/> irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m pore nylon cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2 culture incubator, 37 &#176;C</td>
			<td>Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>35 &#181;m nylon mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber slides</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqueous mounting medium containing DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>A nuclear fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Level 2 certified</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5002</td>
			<td>1 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Allegra 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34554</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytochalasin D</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase 1U/mL</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>07923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Far-Red pro-dye</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C34564</td>
			<td>5 mM stock solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td>For coating 100 mm culture dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope with color digital camera</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>FC-0038</td>
			<td>Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ice bucket and ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microsope with digital camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, low growth factor, phenol-red free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Corning</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-BrdU antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>5292S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG antibody (negative control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors and tips, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td>
			<td>Lifeline Cell Technology</td>
			<td>LL-0041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>R &#38; D Systems</td>
			<td>5135/10</td>
			<td>10 &#956;g/mL PI in PBS stored at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipets, various sizes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for sphere counting and size measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of stem-like cells from 3-dimensional spheroid cultures

Yetişkin kök hücre araştırmalarında gelişmelere rağmen, doku örneklerinden kök hücrelerin tanımlanması ve izole edilmesi büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Yerleşik kök hücreler yetişkin dokularda niş kısıtlamalar ile nispeten quiescent iken, onlar çapa içermeyen üç boyutlu (3D) kültür hücre döngüsü girmek ve hem simetrik hem de asimetrik hücre bölünmesi geçmesi, hem kök ve ata yol açan Hücre. İkincisi hızla çoğalır ve heterojen sferoidler oluşturan, soy taahhüdü çeşitli aşamalarında büyük hücre popülasyonuvardır. Primer normal insan prostat epitel hücreleri (HPrEC) kullanılarak, küresel tabanlı, etiket tutma testi, tek bir hücre çözümünde spheroid başlatan kök hücrelerin tanımlanmasına ve işlevsel olarak izole edilmesine izin veren geliştirilmiştir.
HPrEC veya hücre hatları, brdu ile 10 gün boyunca iki boyutlu (2D) kültürlü dürveterek, kendi kendini yenileyen kök hücreler de dahil olmak üzere tüm bölücü hücrelerin DNA'sına dahil edilmesine izin verir. Yıkama, 3D kültürüne aktarılmasıyla 5 gün boyunca başlar ve bu süre zarfında kök hücreler asimetrik bölünme yoluyla kendini yeniler ve küresel oluşumu başlatır. Nispeten quiescent kızı kök hücreleri BrdU etiketli ebeveyn DNA korumak iken, kız ataları hızla çoğalır, BrdU etiketi kaybetme. BrdU CFSE veya Far Red pro-boyalar ile değiştirilebilir, hangi FACS tarafından canlı kök hücre izolasyonu izin. Kök hücre özellikleri in vitro küresel formasyon, in vivo doku rejenerasyon uyrukları ve simetrik/asimetrik hücre bölünmelerini belgeleyerek doğrulanır. İzole etiket istinat kök hücreleri, RNA-seq, ChIP-seq, tek hücre yakalama, metabolik aktivite, proteom profilleme, immünositokimya, organoid oluşumu ve in vivo doku rejenerasyonu gibi moleküler ve biyolojik çalışmalarla titizlikle sorgulanabilir. Daha da önemlisi, bu marker-free fonksiyonel kök hücre izolasyon yaklaşımı taze kanser örnekleri ve birden fazla organdan kanser hücre hatları kök benzeri hücreleri tanımlar, geniş uygulanabilirlik düşündüren. Bu kanser kök benzeri hücre biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir, kanser kök benzeri hücreleri hedefleyen ekran ilaç, ve kanserlerde yeni tedavi hedefleri keşfetmek.

Primer normal insan prostat epitel hücreleri fibronektin kaplı kültür yemekleriiçine yerleştirilir ve hücre büyümesi 2D kültürkorunur(Şekil 1a). Bir bazal membran matris ile 3D kültüre transfer üzerine, farklılaşmış epitel hücreleri yavaş yavaş ölür. Sadece prostat kök hücreleri çapasız bir kültürde hayatta kalabilir ve 5 gün içinde spheroidler oluşturabilir(Şekil 1b).
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures at JoVE.com

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

İnsan primer prostat epitel hücreleri kullanarak, kök benzeri hücrelerin küresel tabanlı etiket tutma testi ile fonksiyonel karakterizasyonu için yeni bir biyomarker-free yöntemi ni rapor ediyoruz. BrdU, CFSE veya Far Red 2D hücre etiketlemesi için adım adım bir protokol tanımlanır; üç boyutlu küresel oluşum; immünositokimya ile etiket tutucu kök benzeri hücre tanımlama; ve FACS tarafından izolasyon.

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Kök hücre izolasyonu, mevcut yöntemlerle progenitor hücrelerinin birlikte izole edilmesi nedeniyle büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Karışık atalardan gelen kusan kök hücreleri izole etmek için yeni bir biyomarkeriçermeyen bir titre geliştirdik. Bu küresel tabanlı, etiket tutma testinin en büyük avantajı, CFSE veya Far Red etiketleme kullanarak FACS tarafından kızlarının atalarından canlı kök hücreleri genişletebilir ve izole edebilir.Konvansiyonel tedaviler en prostat kanseri hücrelerinin ortadan kaldırmak iken, kanser kök hücreleri terapötik direnç nedeniyle kalır, böylece hastalığın ilerlemesini sürüş. Kök benzeri hücre izolasyonu, etkili hastalık remisyon için terapötik olarak eş hedeflenebilir yeni genlerin belirlenmesine izin verecektir. Bizim etiket tutma tsay çeşitli doku ve hücrelerden normal kök hücre izolasyonu için geçerli, ve kanser kök hücre araştırma için.Daha da önemlisi, bu sataşme diğer epitel hücreli kanserler için geçerli, meme ve kolorektal kanserler gibi. 100 milimetrelik kültür yemeklerini 2,5 mikrogram fibronektin çözeltisi ile iki mililitre kaplayarak başlayın ve oda sıcaklığında bir gecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra çözeltiyi aspire edin ve kültür yemeklerinin biyogüvenlik kabininde 45 dakika kurumasına izin verin.Bir fibronektin kaplı çanak prostat epitel hücre büyüme orta dokuz mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece karbondioksit inkuvöz sıcak tutmak. 37 santigrat derece su banyosunda dondurulmuş insan prostat epitel hücrelerinin bir şişe çözülme ve sıcak ortamda 10 mililitre hücreleri resuspend. Hücre süspansiyonuna 500 kez 5 dakika santrifüj edin.Sonra aspire ve supernatant atın. Sıcak kültür orta bir mililitre hücreleri resuspend ve önceden ısıtılmış orta ile fibronektin kaplı çanak doğrudan süspansiyon bir mililitre aktarın. Sonra 37 santigrat derece karbondioksit kuvözde çanak kuluçka.Hücreleri birlikte etiketliyorsanız, metin el yazmasında açıklandığı gibi BrdU etiketli hücreleri 10 günlük 2B kültürde hazırlayın. Sonra beş mikromolar CFSE veya Far Kırmızı ekleyin ve 30 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, orta yı dikkatlice boya ile aspire edin ve hücreleri beş mililitre sıcak PBS ile iki kez yıkayın.Daha sonra, el yazması yönlere göre% 05 tripsin EDTA ile enzimatik sindirim gerçekleştirin. Hücreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Hücreler buz gibi, bire bir bazal membran matris ve kültür orta karışımı 3D prostasphere oluşumu için resuspended edildi.3D bodrum matris sisteminde prostasphere kültürünü hazırlamak için, bir gecede dört santigrat derecede bodrum membran matris eritme ve kullanmadan önce buz üzerinde tutmak. Sonra yavaşça buz gibi kültür ortamı eşit hacimli içine buz gibi bodrum membran matris bir mililitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat.500 mikrolitre toplam hacmi için buz gibi bire bir bazal membran matris ve kültür medya karışımı beş kez 10 ila 1/4 insan prostat epitel hücreleri resuspend. Pipet her kuyunun alt kenarına çözüm ve eşit karışımı dağıtmak için plaka girdap. Matrisin katılaması için plakayı 37 derece lik karbondioksit kuvöze 30 dakika yerleştirin.Sonra iyi başına sıcak kültür ortamı bir mililitre ile kaplayın, halka rahatsız değil emin olun. CFSE etiketli prostaspheres hasat için iki mililitre dispase ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırmak için orta değiştirin. Matrisi sindirmek için 37 derecede 37 santigrat derecede plakayı kuluçkaya yatırın, sonra küre karışımını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne koyun.Küreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. 500 mikrolitre sıcak %05 tripsin EDTA'daki peleti yeniden askıya alın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Küreleri 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından %10 FBS ile 500 mikrolitre sıcak PBS ekleyin.Küreleri tamamen ayrıştırmak için 26 kalibrelik bir iğneyle mililitrelik bir şırıngadan geçirin. Hücreleri 500 kez g beş dakika santrifüj edin. Sonra aspire ve supernatant atın.Ölü hücreleri lekelemek ve oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yaslamak için mililitre propidium iyodür başına bir mikrogram ile sıcak kültür ortamının bir mililitre hücreleri resuspend. Santrifüjtekrarlayın ve supernatant atın. Sonra sıcak orta bir mililitre ile hücreleri yıkayın.Santrifüjtekrarlayın ve supernatant atın. Sıcak kültür orta bir mililitre hücreleri resuspend ve 35 mikron gözenek boyutu hücre süzgeç snap kapaklar ile filtreleyerek beş mililitre polistiren yuvarlak alt tüpler hücreleri toplamak. Tripsin dağılmış CFSE etiketli prostasphere hücrelerinFACS analizini yapın.Negatif kontrol olarak etiketlenmemiş hücreleri ve kapıları ayarlamak için pozitif kontrol olarak CFSE etiketli hücreleri kullanmak, kısmi CFSE-yüksek ve CFSE-düşük hücrelerin alt popülasyonlarını sıralamak ve toplamak için örneği çalıştırın. Primer normal insan prostat epitel hücreleri fibronektin kaplı kültür yemeklerine yerleştirildi ve hücre büyümesi 2D kültüründe sürdürüldü. Bir bazal membran matris ile 3D kültüre transfer üzerine, farklılaşmış epitel hücreleri yavaş yavaş öldü ve sadece prostat kök hücreleri kaldı.Prostat epitel hücrelerinin 2B kültüründe çift etiketlemesi ve ardından 3D kültürde küresel oluşum, aynı etiket tutma hücrelerinde BrdU, CFSE ve Far Red'in birlikte lokalizasyonunu göstermiştir. Çift immünboyama etiket istinat hücreleri sitokeratin protein keratin 14 daha düşük seviyelerde sergileyen gösterdi, hücre kavşak proteinE-kadherin azalmış, artmış kök hücre erken marker proteinleri Wnt10b ve ALDH1A1, artmış otofaji proteinLC3, ve artmış miyozin IIB. Ayrıca, küresel tabanlı, etiket tutma testi başarıyla prostat kanseri örneklerinde kanser kök benzeri hücreleri algılar.CFSE etiketli istinat kök benzeri kanser hücreleri ve insan prostat kanseri örneklerinden elde edilen küresel ler, etiketsiz progenitor hücrelere göre azaltılmış E-kadherin proteini sergilemiştir. Bu protokolü denerken, kültür orta hazırlık için sıvı formda matris korumak önemlidir. Bir gecede dört derecede saklayın ve pipet uçlarını matris dağıtmadan önce buz gibi PBS'de soğutun.Sferoid bazlı etiket tutma tahlilleri kullanılarak kök hücrelerin izole edilmesinin ardından kök hücrelerde belirli genleri ve yeni biyobelirteçleri belirlemek için tek hücreli RNA dizilemesi ve proteomik analiz yapılabilir. Canlı kanser kök hücrelerinin küresel tabanlı etiket tutma testi ile izole edilmesi, araştırmacıların kanser kök hücre kaynaklı tümöroidleri in vitro olarak yetiştirmelerini ve yeni anti-kanser ilaçlarını taramalarını mümkün kılabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

Kanser kurulması İnsan Konvansiyonel Osteosarkom Hücre Kültürleri Kök

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Yalıtım Normal kolon ve kolorektal Karsinom - gelişmiş bir iletişim kuralı üzerinden insan endotel hücrelerinin

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...