Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Rafael Prados-Rosales for at dele anti-MEV antisera og Navneet Dogra for at udføre nanopartikel tracking analyse.

1. fremstilling af jern-depleteret medium
<ol><li>Der forberedes 1 liter minimalt medium (MM) ved at opløse 5 g KH2po4,5g L-asparagin, 20 ml glycerol og 2 g dextrose i 900 ml afioniseret vand i en plastikbeholder. Undgå glas for at forhindre jern forurening. Juster pH-værdien til 6,8 med 5 N NaOH og volumen til 1 L med vand.</li>
	<li>Der tilsættes 50 g metal chelaterende harpiks (MCR), og omrystes forsigtigt ved hjælp af en magnetisk Stir-stang i 24 timer ved 4 °C. Steriliser og fjern MCR v...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

Flere metoder til at rense eukaryote celle-afledte exosomer er blevet udviklet12. I modsætning hertil er der begrænset information om effektive metoder til at rense bakterie afledte EVs7. Effektiv isolering af køretøjer, som er afledt af MTB, skal tage hensyn til de iboende vanskeligheder ved dyrkning af denne sygdomsfremkaldende Mycobacterium. MTB har en lang divisions tid (~ 24 timer) og skal håndteres på biosikkerhedsniveau tre (BSL-3) betingelser. Derfor er det vi...

Mykobakterielle ekstrellulære vesikler (MEVs) er membranbundne nanopartikler, 60 − 300 Nm i størrelse, der naturligt frigives af hurtigt og langsomt voksende mykobakterier1. Mevs frigivet af patogene mykobakterier udgør en mekanisme til at interagere med værten via immunologisk aktive proteiner, lipider, og glycolipider udskilles i en koncentreret og beskyttet måde2,3,4. At karakterisere mevs og forstå deres Biogenese og funktioner, strenge og effektive metoder til vesikel rensning og validering er afgørende. Hidtil har mevs været isoleret fra de kultur filtrater af mykobakterier dyrket i en jern-rige medium1,5,6,7,8.
Tidligere arbejde viste imidlertid, at jern begrænsning i høj grad stimulerer vesikel frigivelse i MTB, eventuelt for at fange jern via mycobactin, en siderophore udskilte i MEVs9. Selv om der er beskrevet procedurer for MEVs-isolering fra MTB-kultur i højt jern medium, er en effektiv metode til at opnå MEVs fra lave jern kulturer ikke blevet rapporteret. Derfor er målet med denne metode at isolere, rense og kvantificere MEVs opnået fra lave jern kulturer, så de kan anvendes til biokemiske og funktionelle analyser og til analyse af genetiske determinanter for vesikel produktion i mykobakterier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

Mykobakterier, herunder Mycobacterium tuberkulose (MTB), det udløsende middel for human tuberkulose, frigiver naturligt ekstracellulære vesikler (EVS), der indeholder immunologisk aktive molekyler. Viden om de molekylære mekanismer af vesikelprotein Biogenesis, indholdet af vesikler, og deres funktioner på patogenet-Host interface er meget begrænset. Håndtering af disse spørgsmål kræver strenge procedurer for isolation, rensning og validering af evt. Tidligere blev det konstateret, at vesikel-produktionen blev forbedret, når M. tuberkulose blev udsat for jern begrænsning, en tilstand, som MTB stødte på i værtsmiljøet. Præsenteret her er en komplet og detaljeret protokol til at isolere og rense EVs fra jern-mangelfulde mykobakterier. Der anvendes kvantitative og kvalitative metoder til validering af renset EVs.

MEVs blev renset ved differentiel sedimentering i en massefylde gradient (figur 1, figur 2). Under de beskrevne forhold adskilte MEVs hovedsagelig i gradient fraktion 3 (F3), hvilket svarer til 25% iodixanol. Denne konklusion er baseret på påvisning af protein, membran lipid, mikroskopisk visualisering af intakt MEVs, nanopartikel størrelsesfordeling, og positiv reaktivitet med et antivesikel antiserum (fi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacterium tuberkulose viser øget produktion og frigivelse af ekstracellulære vesikler som reaktion på lave jern forhold. Dette arbejde beskriver en protokol til generering af lave jern forhold og metoder til rensning og karakterisering af mykobakterielle ekstracellulære vesikler frigivet som reaktion på jernmangel.

Isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler produceret af jern begrænsede mykobakterier

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Denne metode tillader dyrkning Mycobacterium tuberkulose under strenge lave jernbetingelser og rensende membran vesicles fra den lave jernkultur filtrat. Fordi jern begrænsning er kendt for at stimulere membran vesicle produktion, denne protokol giver høj overflod af ren membran vesikler, der kan udnyttes til yderligere biokemiske eller funktionelle analyser. Når vi demonstrerer protokollen ved hjælp af Mycobacterium smegmatis, den ikke-virulente stamme, kan denne protokol følges i BSL-2 faciliteter ved hjælp af Mycobacterium tuberkulose, den virulente stamme.Til at begynde, forberede en liter minimal medium ved at opløse fem gram monopotassium fosfat, fem gram L-asparagine, 20 milliliter glycerol, og to gram dextrose i 900 milliliter deioniseret vand i en plastbeholder. Juster pH-chloren til 6,8 med fem normale natriumhydroxid og juster lydstyrken til en liter med deioniseret vand. Derefter tilsættes 50 gram metal chelaterende harpiks og forsigtigt omrøres ved hjælp af en magnetisk røre bar i 24 timer ved fire grader Celsius.Den næste dag, stoppe omrøring og lad harpiks sediment i ca 30 minutter. Den resterende harpiks steriliseres og fjernes fra opløsningen ved filtrering gennem en 22 mikronfilterenhed med en plastikmodtager. Nu, supplere minimal medium med 0.5 milligram per liter zinkchlorid, 40 milligram per liter magnesiumsulfat, og 0.1 milligram per liter mangan sulfat.Inokuler en enkelt koloni MTB i to milliliter mycobakteriel bouillon medium suppleret med ADN berigelse. Inkubere med omrøring ved 37 grader Celsius. Når der er synlig vækst, udtrækkes to milliliter af kulturen og mål OD 540 på et spektrofotometer.Stop inkubationen, når OD 540 når 0,8, hvilket angiver den sene logaritmiske fase. Spred 200 mikroliter af den sene logaritmiske kultur på mycobakterielle agar plader suppleret med 0,2 glycerol, 0,5% Tween 80, og ADN. Inokuler mindst fem plader.Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius. Og efter en uge er bakterievæksten synlig som et sammenløbslag. Derefter våd en steril vatpind i et lavt jern minimalt medium.Brug denne podepind til at indsamle bakterier fra agarpladerne. Inokuler bakterierne i 100 milliliter lavt jern minimalt medie i et rør. Indsamle tilstrækkelige bakterier til at forberede en suspension med en OD 540 af en.Fortynd suspensionen 10 gange til en liter med lavt jern minimalt medium og del den i to sterile plastflasker. Dernæst overføre to milliliter af kulturen til en fem milliliter kultur rør. Der tilsættes 10 mikroliter med 10 % volumen efter volumentyloxapol.Inkuber kulturerne ved 37 grader Celsius i 14 dage. Overfør kulturen til fem 225 milliliter koniske centrifugerør og centrifuge ved 2, 850 gange g i syv minutter ved 20 grader Celsius. Opsaml kultursupernatanten med en 50 milliliterpipette, og filtrer den steriliseres gennem et 0,22 mikronfilter.For at isolere MEV'er skal kulturfiltratet overføres til et omrørt celle ultrafiltreringssystem placeret ved fire grader Celsius og filtreres koncentratet ved et tryk på mindre end 50 PSI gennem en 100 kilodalton cutoff-membran. Derefter centrifuge den koncentrerede kultur filtrat ved 15, 000 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius og indsamle supernatant i polycarbonat ultracentrifugering rør. Centrifuge supernatant ved 100, 000 gange g i to timer ved fire grader Celsius.Derefter fjernes supernatanten og opsbruges de membranøse pellets i i alt en milliliter steril PBS ved skånsom pipettering. Bland 0,5 milliliter pellet suspension med 1,5 milliliter 60% iodixanol opløsning i bunden af en polypropylen tynd walled ultracentrifuge rør. Overlejr denne MVE iodixanol 45%suspension med en milliliter på 40%35%30%25% og 20% iodixanol opløsninger og en milliliter PBS øverst.Centrifuge ved 100, 000 gange g i 18 timer ved fire grader Celsius. Brug derefter en en milliliter Hamilton-sprøjte til at indsamle de ene millilitertæthedsgradfraktioner, der starter fra toppen. Hver opsamlet fraktion fortyndes til 20 milliliter med PBS og centrifugeres ved 100,000 gange g i to timer ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten og resuspend i 0,5 milliliter PBS. Opbevar rørene ved fire grader Celsius. For at udføre membran lipid analyse, kombinere 10 mikroliter af hver gradient fraktion med fluorescerende membran sonde TMA-DPH ved en endelig koncentration af et mikrogram per milliliter i 50 mikroliter af PBS i hver brønd af en 96-godt sort plade.Inkuber pladerne ved 33 grader Celsius i 20 minutter. Fluorescensen måles ved 360 nanometer for excitation og 430 nanometer for emission. I denne protokol blev MEVs renset ved differentialsedimentering i en tæthedsgradient.Under de beskrevne betingelser blev MEVs for det meste adskilt i gradient fraktion tre, som svarer til 25% iodixanol. Vesicle-associerede proteiner var koncentreret i fraktion tre vist ved dot blot analyse. Negativ farvning bekræftede også tilstedeværelsen af MEVs i fraktion tre og nanopartikel analyse viste størrelsen af MEV var omkring 100 nanometer.Protein og lipid koncentration normaliseret til koloni danner enheder viste en ca otte gange stigning i MEV udbytte i lavt jern i forhold til høje jernforhold. Dot blot analyse viste et mere intenst signal fra MEV-associerede markører i densitet gradient fraktioner fra jern begrænset MTB kultur end fra jern tilstrækkelig MTB kulturer. Følg instruktionerne for fremstilling af minimal medium for at sikre jern begrænsede betingelser og forhindre forurening af membranen vesikler med lipoprotein aggregater.Den mykobakterielle membran vesicles renset på denne måde kan bruges til biokemisk karakterisering og funktionel analyse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse af epitelbeskadigelse Produceret af<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Forenklet human neutrofil Ekstracellulære Fælder (NET) Isolering og Håndtering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Isolering og karakterisering af neutrofiler med antitumoregenskaber

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolering og Flowcytometrisk karakterisering af murine Lille Intestinal Lymfocytter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering af Humane monocytafledte dendritiske celler fra Imaging flowcytometri: en sammenligning mellem to Monocyt Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fænotypisk karakterisering af makrofager fra rottenyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry at analysere Antigen Spectra af Virioner og ekstracellulære vesikler

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolation, karakterisering og rensning af makrofager fra væv ramt af fedme-relaterede Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering og karakterisering af neutrofile-afledte mikropartikler for funktionelle studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler fra voksen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...