Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

We zijn Rafael Prados-Rosales dankbaar voor het delen van de anti-MeV antisera en Navneet Dogra voor het uitvoeren van nanodeeltjes Tracking Analysis.

1. bereiding van met ijzer uitgeput gedefinieerd medium
<ol><li>Bereid 1 L minimaal medium (MM) door het oplossen van 5 g KH2po4, 5 g L-Asparagine, 20 ml glycerol en 2 g dextrose in 900 ml gedeïoniseerd water in een plastic container. Vermijd glas om ijzer verontreiniging te voorkomen. Pas de pH op 6,8 met 5 N NaOH en het volume op 1 L met water.</li>
	<li>Voeg 50 g metaal chelaat hars (MCR) toe en roer voorzichtig met een magnetische roer stang gedurende 24 uur bij 4 °C. Steriliseren en verwijd...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het zuiveren van eukaryote celafgeleide exosomen12. Er is daarentegen beperkte informatie beschikbaar over effectieve methoden voor het zuiveren van door bacteriën afgeleide Ev's7. Efficiënte isolatie van Ev's met MTB-derivaten moet rekening houden met de intrinsieke moeilijkheden bij het kweken van deze pathogene Mycobacterium. MTB heeft een lange delings tijd (~ 24 uur) en moet worden behandeld in de bioveiligheid niveau drie (B...

Mycobacteriële extracellulaire blaasjes (mev's) zijn membraan gebonden nanodeeltjes, 60 − 300 nm in grootte, natuurlijk vrijgegeven door snel-en langzaam groeiende mycobacteriën1. Mev's vrijgegeven door pathogene mycobacteriën vormen een mechanisme om te communiceren met de gastheer via immunologisch actieve eiwitten, lipiden, en glycolipiden uitgescheiden in een geconcentreerde en beschermde manier2,3,4. Om mevs te karakteriseren en hun biogenese en functies te begrijpen, zijn strikte en efficiënte methoden voor het zuiveren en valideren van blaasje cruciaal. Tot nu toe zijn mev's geïsoleerd van de cultuur filtraten van mycobacteriën geteeld in een ijzerrijke medium1,5,6,7,8.
Echter, vorig werk toonde aan dat ijzer beperking sterk stimuleert blaasje vrijlating in MTB, mogelijk om ijzer vast te leggen via mycobactin, een siderophore uitgescheiden in mevs9. Hoewel er een beschrijving is gegeven van de procedures voor Mev's die geïsoleerd zijn van MTB-culturen in een hoog ijzer medium, is er geen efficiënte methodologie gerapporteerd voor het verkrijgen van Mev's uit een laag ijzergehalte. Daarom is het doel van deze methode het isoleren, zuiveren en kwantificeren van mev's die zijn verkregen uit lage ijzer culturen, zodat ze kunnen worden gebruikt voor biochemische en functionele testen en voor de analyse van genetische determinanten van blaasje productie in mycobacteriën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

Mycobacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculose (MTB), de veroorzaker van humane tuberculose, brengen natuurlijke extracellulaire blaasjes (ev's) met immunologisch actieve moleculen vrij. Kennis over de moleculaire mechanismen van blaasje biogenese, de inhoud van de blaasjes, en hun functies op de pathogeen-hostinterface is zeer beperkt. Het aanpakken van deze vragen vergt strenge procedures voor isolatie, zuivering en validering van Ev's. Eerder bleek de productie van blaasje te worden verbeterd toen M. tuberculose werd blootgesteld aan ijzer beperking, een aandoening die door MTB in de hostomgeving wordt ondervonden. Hier gepresenteerd is een compleet en gedetailleerd protocol om Ev's te isoleren en te zuiveren van ijzer deficiënte mycobacteriën. Er worden kwantitatieve en kwalitatieve methoden toegepast om gezuiverde Ev's te valideren.

Mev's werden gezuiverd door differentiële sedimentatie in een dichtheidsgradiënt (Figuur 1, Figuur 2). Onder de beschreven omstandigheden scheidden Mev's meestal in gradiënt breuk 3 (F3), wat overeenkomt met 25% iodixanol. Deze conclusie is gebaseerd op de detectie van eiwitten, membraan lipide, microscopische visualisatie van intact MEVs, nanodeeltjes grootteverdeling, en positieve reactiviteit met een antivesicle antiserum (...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.

Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Deze methode maakt het mogelijk mycobacterium tuberculosis te kweken onder strikte lage ijzeren omstandigheden en het zuiveren van membraanveikjes uit de lage ijzercultuur filtraat. Omdat ijzerbeperking bekend is om de productie van membraan vesicle te stimuleren, levert dit protocol een hoge overvloed aan zuivere membraanveikels op die kunnen worden gebruikt voor verdere biochemische of functionele tests. Wanneer we het protocol demonstreren met behulp van de Mycobacterium smegmatis, de niet-beschermde stam, kan dit protocol worden gevolgd in BSL-2-faciliteiten met Mycobacterium tuberculosis, de virulente stam.Om te beginnen, bereid een liter minimaal medium door het oplossen van vijf gram monopotassium fosfaat, vijf gram L-asperine, 20 milliliter glycerol, en twee gram dextrose in 900 milliliter gedeïmiseerd water in een plastic container. Pas de pH aan op 6,8 met vijf normale natriumhydroxide en pas het volume aan op één liter met gedeïsized water. Voeg vervolgens 50 gram metalen chelaatlende hars toe en roer zachtjes met behulp van een magnetische roerbalk gedurende 24 uur bij vier graden Celsius.De volgende dag, stop het roeren en laat de hars sediment voor ongeveer 30 minuten. Steriliseren en verwijderen van de resterende hars uit de oplossing door filtratie door middel van een 22 micron filter unit met een plastic ontvanger. Nu, vul minimaal medium met 0,5 milligram per liter zinkchloride, 40 milligram per liter magnesiumsulfaat, en 0,1 milligram per liter mangaansulfaat.Inenting een enkele kolonie MTB in twee milliliter mycobacteriële bouillon medium aangevuld met ADN verrijking. Incubeer met agitatie bij 37 graden Celsius. Wanneer er zichtbare groei is, extract twee milliliter van de cultuur en meet de OD 540 op een spectrofotometer.Stop de incubatie wanneer de OD 540 0,8 bereikt, wat de late logaritmische fase aangeeft. Verspreid 200 microliters van de late logaritmische cultuur op de mycobacteriële agar platen aangevuld met 0,2 glycerol, 0,5%Tween 80, en ADN. Inenting ten minste vijf platen.Broed de platen uit op 37 graden Celsius. En na een week is de bacteriële groei zichtbaar als een samenvloeiende laag. Dan nat een steriele wattenstaafje in een laag ijzer minimaal medium.Gebruik dit uitstrijkje om bacteriën te verzamelen uit de agar platen. Inenting van de bacteriën in 100 milliliter van laag ijzer minimale media in een buis. Verzamel voldoende bacteriën om een suspensie voor te bereiden met een OD 540 van een.Verdun de suspensie 10 keer tot een liter met laag ijzeren minimaal medium en verdeel het in twee steriele plastic flessen. Breng vervolgens twee milliliter van de cultuur over naar een kweekbuis van vijf milliliter. Voeg 10 microliter van 10% volume volume tyloxapol toe.Broed de culturen op 37 graden Celsius voor 14 dagen. Breng de cultuur over op vijf 225 milliliter conische centrifugebuizen en centrifuge op 2, 850 keer g gedurende zeven minuten bij 20 graden Celsius. Verzamel de cultuur supernatant met een 50 milliliter pipet en filter steriliseren door middel van een 0,22 micron filter.Om MEV's te isoleren, breng je de kweekfiltraat over in een geroerd cel ultrafiltratiesysteem geplaatst op vier graden Celsius en filter het concentraat onder een druk van minder dan 50 PSI door een 100 kilodalton cutoff membraan. Centrifugeer vervolgens de geconcentreerde cultuur van 15.000 keer g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant in polycarbonaat ultracentrifugatiebuizen. Centrifuge de supernatant op 100.000 keer g gedurende twee uur bij vier graden Celsius.Verwijder daarna de supernatant en zet de membranous pellets opnieuw op in een totaal van één milliliter steriele PBS door zachte pipetting. Meng 0,5 milliliter van de pelletsuspensie met 1,5 milliliter 60%iodixanol-oplossing aan de onderkant van een polypropyleen dunne ommuurde ultracentrifugebuis. Overlay deze MVE iodixanol 45%suspensie met een milliliter van 40%35%30%25% en 20%iodixanol oplossingen en een milliliter PBS aan de bovenkant.Centrifuge op 100.000 keer g gedurende 18 uur bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een een milliliter Hamilton spuit om de een milliliter dichtheid gradiënt breuken vanaf de top te verzamelen. Verdun elke verzamelde fractie tot 20 milliliter met PBS en centrifuge op 100.000 keer g gedurende twee uur bij vier graden Celsius.Verwijder de supernatant en resuspend in 0,5 milliliter PBS. Bewaar de buizen op vier graden Celsius. Voor het uitvoeren van membraan lipide analyse, combineren 10 microliter van elke gradiënt fractie met de fluorescerende membraan sonde TMA-DPH bij een uiteindelijke concentratie van een microgram per milliliter in 50 microliter PBS in elke put van een 96-goed zwarte plaat.Broed de platen 20 minuten lang in op 33 graden Celsius. Meet de fluorescentie op 360 nanometer voor excitatie en 430 nanometer voor emissie. In dit protocol werden MEV's gezuiverd door differentiële sedimentatie in een dichtheidsgradiënt.Onder de beschreven voorwaarden werden MEV's meestal gescheiden in gradiëntfractie drie, wat overeenkomt met 25%iodixanol. Vesicle-geassocieerde eiwitten werden geconcentreerd in fractie drie getoond door dot vlek analyse. Negatieve kleuring bevestigde ook de aanwezigheid van MEV's in fractie drie en nanodeeltjes analyse toonde de grootte van MEV was ongeveer 100 nanometer.Eiwit- en lipideconcentratie genormaliseerd naar kolonievormende eenheden vertoonden een ongeveer achtvoudige toename van de MEV-opbrengst in laag ijzer ten opzichte van hoge ijzeromstandigheden. Dot blot analyse toonde een intenser signaal van MEV-geassocieerde markers in dichtheid gradiënt fracties van ijzer beperkte MTB cultuur dan van ijzer voldoende MTB culturen. Volg de instructies voor de bereiding van het minimale medium om ijzer beperkte omstandigheden te verzekeren en besmetting van de membraan vesikels met lipoprotein aggregaten te voorkomen.De mycobacteriële membraanveikels die op deze manier gezuiverd worden, kunnen worden gebruikt voor biochemische karakterisering en functionele analyse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infectie

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Isolatie en karakterisering van neutrofielen met Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypische karakterisering van macrofagen van Rat Kidney door flowcytometrie

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry Analyseer antigene Spectra van Virions en extracellulaire blaasjes

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolatie, karakterisering en zuivering van macrofagen uit weefsels beïnvloed door zwaarlijvigheidbetrekking hebbende ontsteking

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolatie en karakterisatie van neutrofiele afkomstige deeltjes voor functionele Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...