Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants à Rafael Prados-Rosales d'avoir partagé l'antisera anti-MEV et Navneet Dogra pour avoir effectué des analyses de suivi des nanoparticules.

1. Préparation du milieu défini appauvri en fer
<ol><li>Préparer 1 L de milieu minimal (MM) en dissolvant 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagine, 20 ml de glycérol et 2 g de dextrose dans 900 ml d'eau deionisée dans un récipient en plastique. Évitez le verre pour prévenir la contamination du fer. Ajuster le pH à 6,8 avec 5 N NaOH et le volume à 1 L avec de l'eau.</li>
	<li>Ajouter 50 g de résine de chélage métallique (MCR) et agiter doucement à l'aide d'une barre magnétique pendant 24 h...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

Plusieurs méthodes pour purifier les exosomes eucaryotes dérivés de cellules ont été développées12. En revanche, il existe peu d'informations sur les méthodes efficaces pour purifier les véhicules électriques dérivés de bactéries7. L'isolement efficace des véhicules électriques dérivés de Mtb doit tenir compte des difficultés intrinsèques à cultiver ce mycobactérie pathogène. Mtb a un temps de division long (24 h) et doit être manipulé dans des condi...

Les vésicules extracellulaires mycobactériennes (MEV) sont des nanoparticules membranaires, de 60 à 300 nm de taille, naturellement libérées par les mycobactéries à croissance rapide et lente1. Les MEV libérés par les mycobactéries pathogènes constituent un mécanisme d'interaction avec l'hôte par l'intermédiaire de protéines immunologiquement actives, lipides et glycolipides sécrétés d'une manière concentrée et protégée2,3,4. Pour caractériser les Monos et comprendre leur biogenèse et leurs fonctions, des méthodes strictes et efficaces de purification et de validation des vésicules sont cruciales. Jusqu'à présent, les MEV ont été isolés des filtrates de culture des mycobactéries cultivées dans un milieu riche en fer1,5,6,7,8.
Cependant, des travaux antérieurs ont démontré que la limitation du fer stimule grandement la libération de vésicule dans Mtb, peut-être pour capturer le fer par l'intermédiaire de la mycobactine, un siderophore sécrété dans meVs9. Bien que des procédures d'isolement des MVE par rapport à la culture Mtb dans un milieu de fer élevé aient été décrites, une méthodologie efficace pour obtenir des MPV à partir de cultures de fer faible n'a pas été signalée. Par conséquent, l'objectif de cette méthode est d'isoler, purifier et quantifier les Monovirus obtenus à partir de cultures de fer faible afin qu'ils puissent être utilisés pour des essais biochimiques et fonctionnels et pour l'analyse des déterminants génétiques de la production de vésicules chez les mycobactéries.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

Les mycobactéries, y compris Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent causal de la tuberculose humaine, libèrent naturellement des vésicules extracellulaires (VE) contenant des molécules immunologiquement actives. Les connaissances concernant les mécanismes moléculaires de la biogenèse vésicule, le contenu des vésicules et leurs fonctions à l'interface pathogène-hôte sont très limitées. Pour répondre à ces questions, il faut des procédures rigoureuses d'isolement, de purification et de validation des véhicules électriques. Auparavant, la production de vésicules s'est avérée améliorée lorsque M. tuberculosis a été exposé à la restriction de fer, une condition rencontrée par Mtb dans l'environnement hôte. Présenté ici est un protocole complet et détaillé pour isoler et purifier les véhicules électriques à partir de mycobactéries déficientes en fer. Des méthodes quantitatives et qualitatives sont appliquées pour valider les véhicules électriques purifiés.

Les Monospaces ont été purifiés par sédimentation différentielle dans un gradient de densité (Figure 1, Figure 2). Dans les conditions décrites, les MEV se sont séparés principalement en fraction de gradient 3 (F3), ce qui correspond à 25% d'iodixanol. Cette conclusion est basée sur la détection de protéines, de lipides membranaires, de visualisation microscopique de Monomètres intacts, de distribution de la taille ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacterium tuberculosis montre une augmentation de la production et la libération de vésicules extracellulaires en réponse à de faibles conditions de fer. Ce travail détaille un protocole pour générer de faibles conditions de fer et des méthodes pour la purification et la caractérisation des vésicules extracellulaires mycobactériennes libérées en réponse à une carence en fer.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Cette méthode permet de faire la culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions strictes de bas fer et de purifier les vésicules membranaires du filtrate à faible culture du fer. Puisque la limitation de fer est connue pour stimuler la production de vésicule de membrane, ce protocole produit l’abondance élevée des vésicules pures de membrane qui peuvent être utilisées pour d’autres essais biochimiques ou fonctionnels. Lorsque nous démontrons le protocole utilisant le Smegmatis Mycobacterium, la souche nonvirulent, ce protocole peut être suivi dans les installations BSL-2 utilisant Mycobacterium tuberculosis, la souche virulente.Pour commencer, préparez un litre de milieu minimal en dissolvant cinq grammes de phosphate de monopotassium, cinq grammes de L-asparagine, 20 millilitres de glycérol et deux grammes de dextrose dans 900 millilitres d’eau déionisée dans un récipient en plastique. Réglez le pH à 6,8 avec cinq hydroxyde de sodium normal et ajustez le volume à un litre avec de l’eau déionisée. Ajouter ensuite 50 grammes de résine de chélating métallique et agiter doucement à l’aide d’une barre magnétique pendant 24 heures à quatre degrés Celsius.Le lendemain, arrêtez l’agitation et laissez le sédiment de résine pendant environ 30 minutes. Stériliser et retirer le reste de la résine de la solution par filtration à travers une unité de filtre de 22 microns avec un récepteur en plastique. Maintenant, compléter le milieu minimal avec 0,5 milligramme par litre de chlorure de zinc, 40 milligrammes par litre de sulfate de magnésium, et 0,1 milligramme par litre de sulfate de manganèse.Inoculer une seule colonie de VTT en deux millilitres de bouillon mycobactérien moyen complété par l’enrichissement ADN. Incuber avec agitation à 37 degrés Celsius. Lorsqu’il y a croissance visible, extraire deux millilitres de la culture et mesurer l’OD 540 sur un spectrophotomètre.Arrêtez l’incubation lorsque l’OD 540 atteint 0,8, ce qui indique la phase logarithmique tardive. Étendre 200 microlitres de la culture logarithmique tardive sur les plaques d’agar mycobactériennes complétées par 0,2 glycérol, 0,5% tween 80 et ADN. Inoculer au moins cinq assiettes.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius. Et après une semaine, la croissance bactérienne est visible comme une couche confluente. Ensuite, mouiller un coton-tige stérile dans un milieu minimal de fer faible.Utilisez cet écouvillon pour recueillir les bactéries dans les plaques d’agar. Inoculer les bactéries en 100 millilitres de faible teneur en fer minimal dans un tube. Recueillir suffisamment de bactéries pour préparer une suspension avec un OD 540 d’un.Diluer la suspension 10 fois à un litre avec un milieu minimal à faible teneur en fer et la diviser en deux bouteilles en plastique stériles. Ensuite, transférez deux millilitres de la culture dans un tube de culture de cinq millilitres. Ajouter 10 microlitres de 10% de volume par volume tyloxapol.Incuber les cultures à 37 degrés Celsius pendant 14 jours. Transférer la culture à cinq tubes de centrifugeuse conique de 225 millilitres et centrifugeuses à 2 850 fois g pendant sept minutes à 20 degrés Celsius. Recueillir le supernatant de culture avec une pipette de 50 millilitres et filtre stériliser à travers un filtre de 0,22 micron.Pour isoler les MEV, transférez le filtrate de culture dans un système d’ultrafiltration cellulaire agité placé à quatre degrés Celsius et filtrez le concentré à une pression inférieure à 50 PSI à travers une membrane de coupure de 100 kilodaltons. Puis centrifugeuse le filtrate de culture concentrée à 15 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et recueillir le supernatant dans des tubes d’ultracentrifugation en polycarbonate. Centrifugeuse le supernatant à 100 000 fois g pendant deux heures à quatre degrés Celsius.Après cela, retirez le supernatant et resuspendez les granulés membranous dans un total d’un millilitre de PBS stérile par pipetting doux. Mélanger 0,5 millilitres de la suspension à granulés avec 1,5 millilitres de solution 60% iodixanol au fond d’un tube d’ultracentrifugeuse à parois minces en polypropylène. Superposez cette suspension MVE iodixanol 45% avec un millilitre de 40%35%30%25%et 20% de solutions iodixanol et un millilitre de PBS en haut.Centrifugeuse à 100 000 fois g pendant 18 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, utilisez une seringue Hamilton d’un millilitre pour recueillir les fractions de gradient de densité d’un millilitre à partir du sommet. Diluer chaque fraction recueillie à 20 millilitres avec PBS et centrifugeuse à 100 000 fois g pendant deux heures à quatre degrés Celsius.Retirez le supernatant et resuspendez en 0,5 millilitres de PBS. Conserver les tubes à quatre degrés Celsius. Pour effectuer l’analyse des lipides membranaires, combinez 10 microlitres de chaque fraction de gradient avec la sonde à membrane fluorescente TMA-DPH à une concentration finale d’un microgramme par millilitre dans 50 microlitres de PBS dans chaque puits d’une plaque noire de 96 puits.Incuber les plaques à 33 degrés Celsius pendant 20 minutes. Mesurer la fluorescence à 360 nanomètres pour l’excitation et 430 nanomètres pour l’émission. Dans ce protocole, les MEV ont été purifiés par la sédimentation différentielle dans un gradient de densité.Dans les conditions décrites, les MEV ont été séparés principalement dans la fraction de gradient trois qui correspond à 25% iodixanol. Les protéines associées aux vésicules ont été concentrées dans la fraction trois indiquée par l’analyse de tache de point. La coloration négative a également confirmé la présence de MEVs dans la fraction trois et l’analyse de nanoparticules a montré que la taille du MEV était d’environ 100 nanomètres.La concentration en protéines et en lipides normalisée en unités formant des colonies a montré une augmentation d’environ huit fois le rendement en MEV en fer faible par rapport à des conditions de fer élevées. L’analyse de tache de point a montré un signal plus intense des marqueurs MEV-associés dans des fractions de gradient de densité de la culture limitée de MTB de fer que des cultures suffisantes de VTT de fer. Suivez les instructions pour la préparation du milieu minimal afin d’assurer des conditions limitées en fer et de prévenir la contamination des vésicules membranaires par des agrégats de lipoprotéines.Les vésicules de membrane mycobactérienne purifiées de cette manière peuvent être employées pour la caractérisation biochimique et l’analyse fonctionnelle.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse de l&#39;altération de l&#39;épithélium Produit par<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Maladies infectieuses

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Recherche

Immunologie et infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Isolement et caractérisation de neutrophiles avec des propriétés anti-tumorales

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

L&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle Lymphocytes murine

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d&#39;isolement

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caractérisation phénotypique des macrophages du Rat Kidney par cytométrie de flux

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Débit Virometry pour l&#39;analyse antigénique Spectra de virions et extracellulaires Vésicules

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolement et caractérisation de microparticules neutrophile dérivés pour des études fonctionnelles

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires d’adultes Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...