Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
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Siamo grati a Rafael Prados-Rosales per aver condiviso l'antisera anti-MEV e Navneet Dogra per aver eseguito l'analisi del monitoraggio delle nanoparticelle.

1. Preparazione del mezzo definito impoverito di ferro
<ol><li>Preparare 1 L di mezzo minimo (MM) sciogliendo 5 g di KH2PO4, 5 g di L-asparagine, 20 mL di glicerolo e 2 g di dextrose in 900 mL di acqua deionizzata in un contenitore di plastica. Evitare il vetro per evitare la contaminazione da ferro. Regolare il pH a 6,8 con 5 N NaOH e il volume a 1 L con acqua.</li>
	<li>Aggiungere 50 g di resina metallica chelante (MCR) e agitare delicatamente con una barra di stirazione magnetica per 24 h a 4 g...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

Sono stati sviluppati diversi metodi per purificare gli esosomi eucarioti derivati dalle cellule12. Al contrario, vi sono informazioni limitate sui metodi efficaci per purificare gli EV7derivati dai batteri. L'isolamento efficiente dei veicoli elettrici derivati da Mtb deve considerare le difficoltà intrinseche nella coltivazione di questo micatacterio patogeno. Mtb ha un lungo tempo di divisione (24 h) e deve essere gestito in condizioni di biosicurezza di livello tre (BS...

Le vescicole extracellulari micobatteriche (MEV) sono nanoparticelle legate alla membrana, di dimensioni di 60-300 nm, naturalmente rilasciate da micobatteri a crescita rapida e lenta1. I MEV rilasciati dai micobatteri patogeni costituiscono un meccanismo per interagire con l'ospite tramite proteine immunologicamente attive, lipidi e glicolipidi secreti in modo concentrato e protetto2,3,4. Per caratterizzare i MEV e comprenderne la biogenesi e le funzioni, sono cruciali metodi rigorosi ed efficienti di purificazione e convalida delle vesciche. Finora, i MEV sono stati isolati dalla coltura filtrati di micobatteri coltivati in un mezzo ricco di ferro1,5,6,7,8.
Tuttavia, il lavoro precedente ha dimostrato che la limitazione del ferro stimola notevolmente il rilascio di vesciche in Mtb,possibilmente per catturare il ferro tramite mycobactin, un siderophore secreto in MEV9. Sebbene siano state descritte le procedure per l'isolamento dei MEV dai Mtb coltivati nell'alto mezzo di ferro, non è stata riportata una metodologia efficiente per ottenere MEV da culture di ferro basso. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è quello di isolare, purificare e quantificare i MEV ottenuti da colture di ferro basse in modo che possano essere utilizzati per saggi biochimici e funzionali e per l'analisi dei determinanti genetici della produzione di vescicoli nei micobatteri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

I micobatteri, tra cui Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agente causale della tubercolosi umana, rilasciano naturalmente vescicoli extracellulari (EV) contenenti molecole immunologicamente attive. La conoscenza dei meccanismi molecolari della biogenesi vescicante, del contenuto delle vescibole e delle loro funzioni nell'interfaccia patogeno-ospite è molto limitata. Per affrontare queste questioni sono necessarie procedure rigorose per l'isolamento, la purificazione e la convalida dei veicoli elettrici. In precedenza, la produzione di vescicola era migliorata quando M. tuberculosis era esposto a restrizione del ferro, una condizione riscontrata da Mtb nell'ambiente host. Presentato qui è un protocollo completo e dettagliato per isolare e purificare i veicoli elettrici dai micobatteri carenti di ferro. I metodi quantitativi e qualitativi vengono applicati per convalidare i VE purificati.

I MEV sono stati purificati dalla sedimentazione differenziale in un gradiente di densità (Figura 1, Figura 2). Nelle condizioni descritte, MEV separati per lo più nella frazione sfumata 3 (F3), che corrisponde al 25% di iodixanol. Questa conclusione si basa sul rilevamento di proteine, lipidi della membrana, visualizzazione microscopica di MEV intatti, distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle e reattività positiva ...

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacterium tuberculosis mostra un aumento della produzione e del rilascio di vescibole extracellulari in risposta a basse condizioni di ferro. Questo lavoro descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di basse condizioni e metodi di ferro per la purificazione e la caratterizzazione delle vesciche extracellulari micobatteriche rilasciate in risposta alla carenza di ferro.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Questo metodo consente di coltivare mycobacterium tuberculosis in condizioni di ferro rigide e purificare le vescicole di membrana dal filtrato a bassa coltura del ferro. Poiché la limitazione del ferro è nota per stimolare la produzione di vescicole a membrana, questo protocollo produce un'elevata abbondanza di vescicole di membrana pure che possono essere utilizzate per ulteriori saggi biochimici o funzionali. Quando dimostriamo il protocollo usando il Mycobacterium smegmatis, il ceppo non verulento, questo protocollo può essere seguito in strutture BSL-2 utilizzando Mycobacterium tuberculosis, il ceppo virulento.Per iniziare, preparare un litro di mezzo minimo sciogliendo cinque grammi di fosfato monopotassio, cinque grammi di L-asparagina, 20 millilitri di glicerolo e due grammi di destrosio in 900 millilitri di acqua deionizzata in un contenitore di plastica. Regolare il pH a 6,8 con cinque idrossido di sodio normale e regolare il volume a un litro con acqua deionizzata. Quindi aggiungere 50 grammi di resina chelatante metallica e agitare delicatamente utilizzando una barra di agitazione magnetica per 24 ore a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, interrompere l'agitazione e lasciare sedimentare la resina per circa 30 minuti. Sterilizzare e rimuovere la resina rimanente dalla soluzione mediante filtrazione attraverso un'unità filtrante da 22 micron con un ricevitore in plastica. Ora, integrare il mezzo minimo con 0,5 milligrammi per litro di cloruro di zinco, 40 milligrammi per litro di solfato di magnesio e 0,1 milligrammi per litro di solfato di manganese.Inoculare una singola colonia di MTB in due millilitri di brodo micobatterico integrato con arricchimento ADN. Incubare con agitazione a 37 gradi Celsius. Quando c'è una crescita visibile, estrarre due millilitri della coltura e misurare l'OD 540 su uno spettrofotometro.Interrompere l'incubazione quando l'OD 540 raggiunge 0,8, il che indica la fase logaritmica tardiva. Stendere 200 microlitri della coltura logaritmica tardiva sulle piastre di agar micobatterico integrate con 0,2 glicerolo, 0,5%Tween 80 e ADN. Inoculare almeno cinque piatti.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius. E dopo una settimana, la crescita batterica è visibile come uno strato confluente. Quindi bagnare un batuffolo di cotone sterile in un mezzo minimo di ferro basso.Utilizzare questo tampone per raccogliere batteri dalle piastre di agar. Inoculare i batteri in 100 millilitri di basso supporto minimo di ferro in un tubo. Raccogliere batteri sufficienti per preparare una sospensione con un OD 540 di uno.Diluire la sospensione da 10 volte a un litro con un mezzo minimo di ferro basso e dividerla in due bottiglie di plastica sterili. Successivamente, trasferire due millilitri della coltura in un tubo di coltura da cinque millilitri. Aggiungere 10 microlitri del 10% volume per volume tyloxapol.Incubare le colture a 37 gradi Celsius per 14 giorni. Trasferire la coltura a cinque tubi di centrifuga conica da 225 millilitri e centrifugare a 2.850 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Raccogliere il supernatante di coltura con una pipetta da 50 millilitri e filtrarlo sterilizzarlo attraverso un filtro da 0,22 micron.Per isolare i MEV, trasferire il filtrato di coltura in un sistema di ultrafiltrazione cellulare mescolato posto a quattro gradi Celsius e filtrare il concentrato a una pressione inferiore a 50 PSI attraverso una membrana di taglio da 100 kilodalton. Quindi centrifugare il filtrato di coltura concentrato a 15.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il supernatante in tubi di ultracentrifugazione in policarbonato. Centrifugare il supernatante a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.Successivamente, rimuovere il supernatante e rimescolare i pellet membranosi in un totale di un millilitro di PBS sterile mediante pipettazione delicata. Mescolare 0,5 millilitri della sospensione a pellet con 1,5 millilitri di soluzione di iodixanolo al fondo di un tubo ultracentrifugo a parete sottile in polipropilene. Sovrapporre questa sospensione MVE iodixanolo 45% con un millilitro del 40%35%30%25% e 20%soluzioni iodixanoli e un millilitro di PBS nella parte superiore.Centrifuga a 100.000 volte g per 18 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, utilizzare una siringa Hamilton da un millilitro per raccogliere le frazioni di gradiente di densità di un millilitro a partire dall'alto. Diluire ogni frazione raccolta a 20 millilitri con PBS e centrifuga a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.Rimuovere il supernatante e resuspend in 0,5 millilitri di PBS. Conservare i tubi a quattro gradi Celsius. Per eseguire l'analisi lipidica della membrana, combinare 10 microlitri di ogni frazione gradiente con la sonda a membrana fluorescente TMA-DPH a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro in 50 microlitri di PBS in ogni pozzo di una piastra nera da 96 pozzetti.Incubare le piastre a 33 gradi Celsius per 20 minuti. Misurare la fluorescenza a 360 nanometri per l'eccitazione e 430 nanometri per l'emissione. In questo protocollo, i MEV sono stati purificati dalla sedimentazione differenziale in un gradiente di densità.Nelle condizioni descritte, i MEV sono stati separati per lo più in frazione gradiente tre che corrisponde al 25% di iodixanolo. Le proteine associate alla vescicola sono state concentrate nella frazione tre mostrata dall'analisi delle macchie di punti. La colorazione negativa ha anche confermato la presenza di MEV nella frazione tre e l'analisi delle nanoparticelle ha mostrato che la dimensione del MEV era di circa 100 nanometri.La concentrazione di proteine e lipidi normalizzata in unità di formazione di colonie ha mostrato un aumento di circa otto volte della resa di MEV in ferro basso rispetto alle elevate condizioni di ferro. L'analisi delle macchie di punti ha mostrato un segnale più intenso da marcatori associati al MEV nelle frazioni di gradiente di densità da colture MTB limitate dal ferro rispetto alle colture MTB sufficienti del ferro. Seguire le istruzioni per la preparazione del mezzo minimo per garantire condizioni limitate al ferro e prevenire la contaminazione delle vescicole di membrana con aggregati di lipoproteina.Le vescicole della membrana micobatterica purificate in questo modo possono essere utilizzate per la caratterizzazione biochimica e l'analisi funzionale.

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