Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
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我々は、ナノ粒子追跡分析を行うための抗MEV抗セラとナヴニート・ドグラを共有してくれたラファエル・プラドス=ロサレスに感謝しています。

1. 鉄枯渇定義媒体の調製
<ol><li>KH2PO4の5g、L-アスパラギン5g、グリセロール20mL、脱イオン水2gをプラスチック容器に900mLで溶解して1Lの最小培地(MM)を調製する。鉄の汚染を防ぐためにガラスを避けてください。pHを5 N NaOHで6.8に調整し、体積を水で1Lに調整します。</li>
	<li>50gの金属キレート樹脂(MCR)を加え、磁気攪拌バーを4°Cで24時間軽く攪拌します。プラスチック受信機で0.22...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

真核細胞由来エキソソームを精製する複数の方法が開発された12.対照的に、細菌由来EV7を精製するための有効な方法に関する情報は限られています。Mtb由来のEVの効率的な分離は、この病原性マイコバクテリウムの成長における本質的な困難を考慮する必要があります。Mtbは長い分割時間(〜24時間)を有し、バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件で扱われるべ?...

マイコバクテリア細胞外小胞(MEV)は、膜結合ナノ粒子であり、60−300nmの大きさで、速く成長する抗酸菌1によって自然に放出される。病原性マイコバクテリアによって放出されるMEVは、免疫学的に活性なタンパク質、脂質、および糖脂質を介して宿主と相互作用するメカニズムを構成し、濃縮および保護された方法で分泌される2、3、4である。MEVを特徴付け、その生体発生と機能を理解するためには、小胞の浄化と検証の厳格かつ効率的な方法が不可欠です。これまで、MEVは鉄分が豊富な培地1、5、6、7、8で増殖したマイコバクテリアの培養濾液から単離されてきた。
しかし、以前の研究は、鉄の制限がMtbの小胞放出を大きく刺激することを実証し、おそらくMEV9で分泌されるシデラクチを介して鉄を捕捉する。高鉄培地で培養したMtbからMEVを分離する手順は説明されているが、低鉄培養物からMEVを得るための効率的な方法論は報告されていない。したがって、この方法の目的は、低鉄培養物から得られたMEVを単離、精製、定量し、生化学的および機能的アッセイやマイコバクテリアにおける小胞産生の遺伝的決定要因の分析に使用することです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

ヒト結核の原因物質である結核菌(Mtb)を含む抗酸菌は、免疫学的に活性な分子を含む細胞外小胞(EV)を自然放出する。小胞生体形成の分子機構、小胞の含有量、および病原体宿主界面におけるその機能に関する知識は非常に限られている。これらの質問に対処するには、EVの分離、精製、検証のための厳格な手順が必要です。以前は、結核が鉄制限にさらされたとき、小胞産生が増強され、宿主環境でMtbが遭遇した状態であることが判明した。ここでは、鉄欠乏性抗酸菌からEVを分離および精製するための完全で詳細なプロトコルです。定量的および定性的な方法が適用され、精製された EV が検証されます。

MEVは密度勾配の差動沈下により精製した(図1、図2)。記載された条件下で、MEVは主に勾配画分3(F3)で分離され、25%のジオオキサンに相当する。この結論は、タンパク質、膜脂質、無傷MEVの顕微鏡的可視化、ナノ粒子サイズ分布、および抗小胞抗血清による陽性反応性の検出に基づいている(図2、<strong cla...

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

結核菌は、低鉄条件に応答して細胞外小胞の産生および放出の増加を示す。本研究では、鉄欠乏症に反応して放出されるマイコバクテリア細胞外小胞の精製および特性評価のための低鉄条件および特性評価のための方法を生成するためのプロトコルを詳しく説明する。

鉄制限性抗酸菌による細胞外小胞の単離と特徴付け

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

この方法は、厳格な低鉄条件下で結核菌を培養し、低鉄培養液から小胞膜を浄化することを可能にする。鉄の制限は膜小胞の産生を刺激することが知られているので、このプロトコルは、さらに生化学的または機能的なアッセイに利用することができる純粋な膜小胞の高い豊富さを生み出す。我々は、マイコバクテリウムスメグマティス、非毒性株を使用してプロトコルを実証する場合、このプロトコルは、結核菌、悪質株を使用してBSL-2施設に従うことができます。まず、5グラムのリン酸モノカリウム、5グラムのL-アスパラギン、20ミリリットルのグリセロール、900ミリリットルの脱イオン水に2グラムのデキストロースをプラスチック容器に溶解させることで、最小限の培地を1リットル用意します。5つの通常の水酸化ナトリウムでpHを6.8に調整し、脱イオン水で1リットルに音量を調整します。その後、50グラムの金属キレート樹脂を加え、摂氏4度で24時間磁気攪拌棒を使用して穏やかに攪拌します。翌日、撹拌を停止し、樹脂を約30分間沈下します。プラスチック製のレシーバで22ミクロンのフィルターユニットを濾過して、残りの樹脂を溶液から殺菌して除去します。今, サプリメントの最小培地を含む 0.5 塩化亜鉛のリットル当たりミリグラム, 40 硫酸マグネシウムのリットル当たり 40 ミリグラム, マンガン硫酸のリットルあたり 0.1 ミリグラム.ADN濃縮を加えたマイコバクテリアブロス培地の2ミリリットルでMTBの単一コロニーを接種する。摂氏37度で撹拌してインキュベートする。目に見える成長がある場合、培養液を2ミリリットル抽出し、分光光度計上でOD 540を測定する。OD 540が、対数後期相を示す0.8に達したときにインキュベーションを停止します。0.2グリセロール、0.5%Tween 80、およびADNを加えたマイコバクテリア寒天プレートに対数後期培養200マイクロリットルを広げます。少なくとも5枚のプレートを接種する。プレートを摂氏37度でインキュベートします。そして1週間後、細菌の増殖はコンフルエント層として見える。その後、低鉄の最小限の媒体で滅菌綿棒を湿まします。寒天プレートから細菌を収集するために、この綿棒を使用してください。チューブ内の低鉄最小培地の100ミリリットルで細菌を接種します。1のOD 540で懸濁液を調製するのに十分な細菌を集める。低鉄の最低媒体で懸濁液を10倍から1リットルに希釈し、2つの無菌ペットボトルに分けます。次に、培養物2ミリリットルを5ミリリットル培養管に移す。ボリュームタイロキサポールで10%の体積の10マイクロリットルを追加します。14日間摂氏37度で培養します。20°Cで7分間2,850回gで5つの225ミリリットル円錐形遠心分離管と遠心分離機に培養を移します。50ミリリットルのピペットで培養上清を収集し、0.22ミクロンのフィルターを通してそれを殺菌するフィルター。MEVを分離するには、培養液を摂氏4度に置かれた攪拌細胞限外濾過システムに移し、100キロダルトンカットオフ膜を通して50未満のPSIの圧力で濃縮物を濾過する。次に、濃縮培養液を摂氏4度で15分間15分間濾液し、ポリカーボネート超遠心チューブに上清を集める。上清を摂氏4度で2時間100,000倍に遠心する。その後、上清を取り除き、穏やかなピペット処理によって滅菌PBSの合計1ミリリットルで膜状ペレットを再懸濁する。ポリプロピレン薄壁の超遠心チューブの底に60%iodiキサノール溶液の1.5ミリリットルとペレット懸濁液の0.5ミリリットルを混合します。このMVEイオディアノール45%懸濁液を40%35%30%25%と20%のiodiキサノール溶液と1ミリリットルのPBSを上部に重ね合わせてください。摂氏4度で18時間100,000倍gの遠心分離機。次に、1ミリリットルのハミルトンシリンジを使用して、上から始まる1ミリリットル密度の勾配分を収集する。各収集した分率をPBSと遠心分離機で20ミリリットルに希釈し、100,000倍gで摂氏4度で2時間希釈します。上清を取り除き、PBSの0.5ミリリットルで再懸濁します。チューブは摂氏4度で保管してください。膜脂質分析を行うために、各勾配分率の10マイクロリットルを蛍光膜プローブTMA-DPHと組み合わせ、96ウェルブラックプレートの各ウェルにPBSの50マイクロリットルで1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度で結合します。プレートを摂氏33度で20分間インキュベートします。励起用360ナノメートル、発光用430ナノメートルで蛍光を測定します。このプロトコルでは、MEVは、密度勾配における微分沈下によって精製された。記載の条件下で、MEVは、25%iodiキサノールに対応する勾配画分3で大部分分離された。ベシクル関連タンパク質は、ドットブロット分析で示した画分3に濃縮した。また、分画3およびナノ粒子分析でMEVの存在を確認した陰性染色は、MEVのサイズが約100ナノメートルであることを示した。コロニー形成単位に正規化されたタンパク質および脂質濃度は、鉄条件の高さに対して低鉄でのMEV収量の約8倍の増加を示した。ドットブロット分析は、鉄の十分なMTB培養よりも鉄限定MTB培養からの密度勾配画分におけるMEV関連マーカーからのより強いシグナルを示した。鉄の限られた条件を保証し、リポタンパク質凝集体と膜小胞の汚染を防ぐために、最小限の媒体の調製のための指示に従ってください。この方法で精製されたマイコバクテリア膜小胞は、生化学的特性評価および機能解析に使用することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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プロデュース上皮損傷の解析<em&gt;赤痢アメーバ</em&gt;感染症

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

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簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

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ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

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Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

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分離と機能研究の好中球由来の微粒子のキャラクタリゼーション

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...