Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
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우리는 나노 입자 추적 분석을 수행하기위한 안티 MEV 항 세라와 Navneet 도그라를 공유 라파엘 프라도스 - 로살레스에 감사드립니다.

1. 철분 고갈 정의 매체의 준비
<ol><li>KH2 PO4,L-아스파라긴 5g,글리세롤 20 mL, 덱스트로오스 2g을 플라스틱 용기에 탈이온수 900 mL에 녹여 최소 배지(MM) 1L를 준비합니다. 철분 오염을 방지하기 위해 유리를 피하십시오. pH를 5 N NaOH로 6.8로 조정하고 부피를 물로 1L로 조정합니다.</li>
	<li>금속 킬레이트 수지(MCR) 50g을 넣고 4°C에서 24시간 동안 마그네틱 교반 막대를 사용하여 부드럽게 교?...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

진핵 세포 유래 엑소좀을 정화하는 여러 방법이12가지개발되었다. 이에 반해, 박테리아 유래 EV7을정화하는 효과적인 방법에 대한 정보는 제한적이다. Mtb 유래 전기 EV의 효율적인 격리는 이 병원성 진균을 성장에 있는 본질적인 어려움을 고려할 필요가 있습니다. Mtb는 긴 분할 시간 (~24 h)을 가지고 있으며 생물 안전 성 수준 3 (BSL-3) 조건에서 처리해야합니다. 따?...

진균성 세포밖 소포 (MEV)는 막 결합 된 나노 입자, 60-300 nm 크기로, 빠르고 느리게 성장하는 진균에 의해 자연적으로 방출됩니다1. 병원성 진균에 의해 방출된 MEV는 면역학적 활성 단백질, 지질 및 글리콜리피드를 통해 숙주와 상호 작용하는 메커니즘을 구성하여 농축 및 보호 방식으로분비되는 2,3,4. MEV를 특성화하고 생물 발생 및 기능을 이해하려면 소포 정화 및 검증의 엄격하고 효율적인 방법이 중요합니다. 지금까지 MEV는 철분이 풍부한 배지1,5,6,7,8에서자란 진균의 배양 여과체로부터 분리되어 왔다.
그러나, 전작에서는 철 제한이 Mtb에서 소포 방출을 크게 자극한다는 것을 보여주었으며, 아마도 MEV9에서분비되는 사이드로포어인 마이코박틴을 통해 철을 포착할 수 있습니다. 높은 철 배지에서 배양된 Mtb로부터의 MEV 격리 에 대한 절차가 설명되었지만, 낮은 철 배양물에서 MEV를 얻는 효율적인 방법은 보고되지 않았다. 따라서, 이 방법의 목적은 낮은 철 배양물에서 얻은 MEV를 분리, 정화 및 정량화하여 생화학 및 기능성 분석및 진균에서 소포 생산의 유전 적 결정요인의 분석에 사용될 수 있도록 하는 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

인간 결핵의 원인원인 인균인 결핵 균(Mtb)을 포함한 마이코박테리아는 면역학적 활성 분자를 함유하는 세포외 소포(EV)를 자연적으로 방출합니다. 소포 생물 발생의 분자 메커니즘, 소포의 함량 및 병원체 숙주 인터페이스에서의 기능에 관한 지식은 매우 제한적입니다. 이러한 문제를 해결하려면 EV의 격리, 정화 및 검증을 위한 엄격한 절차가 필요합니다. 이전에는 M. 결핵이 숙주 환경에서 Mtb에 의해 발생하는 조건인 철제한에 노출되었을 때 소포 생산이 강화되는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 완전하고 상세한 프로토콜은 철결핍 균으로부터 전기자동차를 분리하고 정화하는 것입니다. 정제 된 전기 를 검증하기 위해 정량적 및 질적 방법이 적용됩니다.

MEV는 밀도 구배에서 차등 침전물을 정제하였다(도1, 도 2). 설명된 조건하에서, MEV는 대부분 25% 이오디산올에 해당하는 그라데이션 분획 3(F3)으로 분리되었다. 이러한 결론은 단백질, 막 지질, 손상되지 않은 MEV의 현미경 시각화, 나노입자 크기 분포, 및 항베제 항혈전을 통한 양성 반응성의 검출에 기초한다(도2,</...

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

결핵 균은 낮은 철 조건에 응하여 세포외 소포의 증가된 생산 그리고 방출을 보여줍니다. 이 작품은 철 결핍에 응하여 풀어 놓인 진균 세포외 소포의 정제 그리고 특성화를 위한 낮은 철 조건 및 방법을 생성하기 위한 프로토콜을 상세히 기술합니다.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

이 방법은 엄격한 낮은 철 조건에서 균균 결핵을 배양하고 낮은 철 배양 여과에서 막 소포를 정화할 수 있습니다. 철 제한은 막 소포 생산을 자극하는 것으로 알려져 있기 때문에,이 프로토콜은 추가 생화학적 또는 기능적 분석을 위해 활용할 수있는 순수한 멤브레인 소포의 높은 풍부를 산출한다. 우리는 진균 세균염, 비룰런트 균주를 사용하여 프로토콜을 시연 할 때, 이 프로토콜은 진균 결핵, 악성 균주를 사용하여 BSL-2 시설에서 수행 될 수있다.우선, 5그램의 모노포타슘 인산염, L-아스파라진 5그램, 글리세롤 20밀리리터, 플라스틱 용기에 900밀리리터의 덱스트로스 2그램을 용해하여 최소 배지 1리터를 준비한다. 5개의 일반 수산화나트륨으로 pH를 6.8로 조정하고 탈온화된 물로 1리터로 부피를 조절한다. 그런 다음 50그램의 금속 킬라팅 수지와 자기 저어바를 사용하여 섭씨 4도에서 24시간 동안 부드럽게 교반합니다.다음 날, 교반을 멈추고 수지 퇴적물을 약 30 분 동안 놓습니다. 플라스틱 수신기가 있는 22 미크론 필터 장치를 통해 여과하여 용액에서 남은 수지물을 살균하고 제거합니다. 이제 염화 아연 리터당 0.5 밀리그램, 황산 마그네슘 리터당 40밀리그램, 망간 황산염 리터당 0.1밀리그램으로 최소 배지를 보충하십시오.ADN 농축액으로 보충된 진균 국물 배지의 2밀리리터에 MTB의 단일 콜로니를 접종합니다. 섭씨 37도에서 동요로 배양하십시오. 눈에 보이는 성장이있을 때, 문화의 두 밀리리터를 추출하고 분광계에 OD 540을 측정합니다.OD 540이 0.8에 도달하면 배양을 중지하여 후기 로그산스믹 단계를 나타냅니다. 0.2 글리세롤, 0.5%Tween 80 및 ADN으로 보충된 진균 식천 접시에 후기 로고산계 배양 200마이크로리터를 확산시켰다. 적어도 5 개의 플레이트를 접종하십시오.섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 그리고 1 주일 후, 세균 성장은 수렴 층으로 볼 수 있습니다. 그런 다음 멸균 면봉을 낮은 철에 최소한의 매체로 적시어.이 면봉을 사용하여 한천 접시에서 박테리아를 수집하십시오. 튜브에 낮은 철 최소 매체의 100 밀리리터에 박테리아를 접종. OD 540으로 현탁액을 준비하기에 충분한 박테리아를 수집합니다.서스펜션을 1리터에서 1리터로 낮게 희석하고 중간 크기로 희석하고 멸균 플라스틱 병 2개로 나눕니다. 다음으로, 문화의 2 밀리리터를 5밀리리터 배양 튜브로 옮는다. 볼륨 타이록사폴에 의해 10% 볼륨의 마이크로리터 10을 추가합니다.14일 동안 섭씨 37도에서 문화를 배양합니다. 문화를 섭씨 20도에서 7분간 225밀리리터 원심분리기 튜브와 원심분리기 5개로 옮기십시오. 50 밀리리터 파이펫으로 배양 상체를 수집하고 필터는 0.22 미크론 필터를 통해 살균합니다.MEV를 분리하기 위해 배양 여과를 섭씨 4도에 배치한 교반세포 초여과 시스템으로 옮기고 100킬로달톤 차단막을 통해 50PSI 미만의 압력으로 농축물을 필터링한다. 그런 다음 농축 배양 여과를 섭씨 4도에서 15분 동안 15배, 000배에서 원심분리하고 폴리카보네이트 극심분리관에서 상퍼탄을 수집한다. 상심분리는 섭씨 4도에서 2시간 동안 100, 000배g에서 상피합니다.그 후, 상체를 제거하고 부드러운 파이펫팅에 의해 멸균 PBS의 총 1 밀리리터에서 음골 펠릿을 다시 중단합니다. 폴리프로필렌 얇은 벽초센심분리기 튜브 의 바닥에 60%의 iodixanol 용액의 1.5 밀리리터와 펠릿 서스펜션의 0.5 밀리리터를 혼합합니다. 이 MVE iodixanol 45% 서스펜션과 40%35%30%25%,20%의 iodixanol 솔루션과 1밀리리터의 PBS를 상단에 오버레이합니다.원심분리기는 섭씨 4도에서 18시간 동안 100g, 000배. 다음으로, 1 밀리리터 해밀턴 주사기를 사용하여 상단에서 시작하여 밀리리터 밀도 그라데이션 분획1개를 수집합니다. 수집된 각 분획을 PBS와 원심분리기로 20밀리리터로 희석하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 000배 씩 PBS와 원심분리기를 희석합니다.PBS의 0.5 밀리리터에서 상체를 제거하고 다시 중단하십시오. 튜브를 섭씨 4도에 보관하십시오. 멤브레인 지질 분석을 수행하기 위해 각 그라데이션 분획의 10 마이크로리터를 형광막 프로브 TMA-DPH와 결합하여 96웰 블랙 플레이트의 각 웰에 있는 PBS의 50 마이크로리터에 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도를 결합합니다.플레이트를 섭씨 33도에서 20분간 배양합니다. 발광을 위해 360 나노미터및 430 나노미터의 방출을 측정합니다. 이 프로토콜에서 MEV는 밀도 그라데이션에서 차동 침전에 의해 정제되었다.설명된 조건하에서, MEV는 25%iodixanol에 대응하는 그라데이션 분획 3에서 주로 분리되었다. 소포 관련 단백질은 도트 블롯 분석에 의해 표시된 분획 3개에 집중되었다. 부정적인 염색은 또한 3분분및 나노입자 분석에서 MEV의 존재를 확인했으며 MEV의 크기는 약 100 나노미터였다.콜로니 성형 단위로 정규화된 단백질 및 지질 농도는 높은 철 조건에 비해 낮은 철에서 MEV 수율의 약 8배 증가를 나타냈다. 도트 블롯 분석은 철에 충분한 MTB 배양보다 철 제한된 MTB 배양에서 밀도 그라데이션 분획에 있는 MEV 관련 마커로부터 보다 강렬한 신호를 보였다. 최소 배지의 준비 지침은 철 제한 조건을 보장하고 지단백질 골재로 막 소포의 오염을 방지합니다.이러한 방식으로 정제된 진균막 소포는 생화학적 특성화 및 기능분석에 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

연구

면역학 및 감염병학

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

비리의 항원 스펙트럼과 세포 외 소포를 분석하는 Virometry 흐름

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

절연 및 Extracellular 소포 특성 성인 Schistosoma 나무 에서

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...