Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Vi er takknemlige for Rafael Prados-Rosales for å dele anti-MEV antisera og Navneet Dogra for å utføre nanopartikkel sporings analyse.

1. utarbeidelse av jern-utarmet definert medium
<ol><li>Forbered 1 L av minimal medium (MM) ved å oppløse 5 g av KH2PO4,5g av L-asparagin, 20 ml glyserol og 2 g druesukker i 900 ml deionisert vann i en plastbeholder. Unngå glass for å hindre jern forurensning. Juster pH til 6,8 med 5 N NaOH og volumet til 1 L med vann.</li>
	<li>Tilsett 50 g metall chelaterande harpiks (MCR) og forsiktig agitere ved hjelp av en magnetisk røre bar i 24 timer ved 4 ° c. Sterilisere og fjern MCR ved filtrering ...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

Flere metoder for å rense eukaryote celle-avledet exosomes har blitt utviklet12. I kontrast er det begrenset informasjon om effektive metoder for å rense bakterier-avledet EV7. Effektiv isolering av MTB-avledet EV ' r må vurdere de iboende vanskelighetene med å dyrke denne patogene Mycobacterium. MTB har en lang divisjon tid (~ 24 h) og bør håndteres i biosafety nivå tre (BSL-3) forhold. Derfor er det viktig å optimalisere effektiviteten av MEV isolasjons metoder. F...

Mykobakterieinfeksjoner ekstracellulære blemmer (Model) er membran bundne nanopartikler, 60 − 300 NM i størrelse, naturlig utgitt av hurtig-og sakte voksende mykobakterier1. Model utgitt av patogene mykobakterier utgjør en mekanisme for å samhandle med verten via immunologisk aktive proteiner, lipider, og glykolipider skilles ut i en konsentrert og beskyttet måte2,3,4. Å karakterisere Model og oppfatte deres kognitiv og funksjonene, streng og effektiv metoder av vesicle rensing og godkjenningen er avgjørende. Hittil har Model blitt isolert fra kulturen filtrates av mykobakterier vokst i en jern-rik medium1,5,6,7,8.
Men tidligere arbeid demonstrerte at jern begrensning sterkt stimulerer vesicle utgivelse i MTB, muligens for å fange jern via mycobactin, en siderophore utskilles i Model9. Selv om prosedyrer for Model isolasjon fra MTB kultivert i høyt jern medium har blitt beskrevet, en effektiv metodikk for å få Model fra lav jern kulturer har ikke blitt rapportert. Derfor er målet med denne metoden å isolere, rense og kvantifisere Model innhentet fra lav jern kulturer slik at de kan brukes til biokjemiske og funksjonelle analyser og for analyse av genetiske faktorer for vesicle produksjon i mykobakterier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

Mykobakterier, inkludert Mycobacterium tuberkulose (MTB), den utløsende Agent for menneskelig tuberkulose, naturlig utgivelse ekstracellulære blemmer (EV) som inneholder immunologisk aktive molekyler. Kunnskap om molekylære mekanismer av vesicle kognitiv, innholdet av blemmer, og deres funksjoner på patogen-vert grensesnittet er svært begrenset. Å ta opp disse spørsmålene krever strenge prosedyrer for isolering, rensing og validering av EV ' r. Tidligere ble det funnet vesicle produksjon som ble forsterket da M. tuberkulose ble utsatt for jern begrensning, en tilstand som ble oppdaget av MTB i vertsmiljøet. Her presenteres en komplett og detaljert protokoll for å isolere og rense EV ' r fra jern mangelfull mykobakterier. Kvantitative og kvalitative metoder brukes for å validere renset EV ' r.

Model ble renset ved differensial sedimentering i en tetthet gradient (figur 1, figur 2). Under forholdene beskrevet, Model separert det meste i gradient brøkdel 3 (F3), som tilsvarer 25% iodixanol. Denne konklusjonen er basert på påvisning av protein, membran lipid, mikroskopisk visualisering av intakt Model, nanopartikkel størrelsesfordeling, og positiv reaktivitet med en antivesicle antiserum (figur 2<...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacterium tuberkulose viser økt produksjon og frigjøring av ekstracellulære blemmer som svar på lave jern forhold. Dette arbeidet detaljer en protokoll for generering av lave jern forhold og metoder for rensing og karakterisering av mykobakterieinfeksjoner ekstracellulære blemmer utgitt som svar på jernmangel.

Isolering og karakterisering av ekstracellulære blemmer produsert av Iron-Limited mykobakterier

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Denne metoden tillater kultering mycobacterium tuberculosis under strenge lave jernforhold og rensende membran vesikler fra lav jern kultur filtrat. Fordi jern begrensning er kjent for å stimulere membran vesikkel produksjon, denne protokollen gir høy overflod av rene membran vesikler som kan benyttes for ytterligere biokjemiske eller funksjonelle analyser. Når vi demonstrerer protokollen ved hjelp av Mycobacterium smegmatis, den ikke-virulente belastningen, kan denne protokollen følges i BSL-2-anlegg ved hjelp av Mycobacterium tuberculosis, den virulent belastningen.Til å begynne, forberede en liter minimalt medium ved å oppløse fem gram monopotassiumfosfat, fem gram L-asparagin, 20 milliliter glyserol og to gram dekstrose i 900 milliliter av deionisert vann i en plastbeholder. Juster pH til 6,8 med fem normale natriumhydroksid og juster volumet til en liter med deionisert vann. Tilsett deretter 50 gram metallchelating harpiks og forsiktig agiter ved hjelp av en magnetisk rørestang i 24 timer ved fire grader Celsius.Neste dag, stopp omrøringen og la harpikssedimentet i ca 30 minutter. Steriliser og fjern gjenværende harpiks fra oppløsningen ved filtrering gjennom en 22 mikron filterenhet med en plastmottaker. Nå supplere minimalt medium med 0,5 milligram per liter sinkklorid, 40 milligram per liter magnesiumsulfat, og 0,1 milligram per liter mangansulfat.Inokuler en enkelt koloni av MTB i to milliliter mykobakteriell kjøttkraft medium supplert med ADN berikelse. Inkuber med agitasjon ved 37 grader Celsius. Når det er synlig vekst, trekk ut to milliliter av kulturen og måle OD 540 på et spektrofotometer.Stopp inkubasjonen når OD 540 når 0,8 som indikerer den sene logaritmiske fasen. Spre 200 mikroliter av sen logaritmisk kultur på mykobakterielle agarplater supplert med 0,2 glyserol, 0,5% Tween 80 og ADN. Inokuler minst fem plater.Inkuber platene ved 37 grader Celsius. Og etter en uke er bakterieveksten synlig som et samløpet lag. Våt deretter en steril bomullspinne i et lavt jern minimalt medium.Bruk denne vattpinnen til å samle bakterier fra agarplatene. Inokuler bakteriene i 100 milliliter med minimalt med lavt jern i et rør. Samle tilstrekkelig bakterier til å forberede en suspensjon med en OD 540 av en.Fortynn suspensjonen 10 ganger til en liter med lavt jern minimalt medium og del den i to sterile plastflasker. Deretter overfører du to milliliter av kulturen til et fem milliliter kulturrør. Legg til 10 mikroliter på 10 % volum i volum tyloxapol.Inkuber kulturene ved 37 grader Celsius i 14 dager. Overfør kulturen til fem 225 milliliter koniske sentrifugerør og sentrifuge på 2, 850 ganger g i syv minutter ved 20 grader Celsius. Samle kulturen supernatant med en 50 milliliter pipette og filter sterilisere den gjennom en 0,22 mikron filter.For å isolere MEVer, overfør kulturfiltrering til et rørt celle ultrafiltreringssystem plassert ved fire grader Celsius og filtrer konsentratet ved et trykk mindre enn 50 PSI gjennom en 100 kilodalton cutoff membran. Sentrifuger deretter den konsentrerte kulturfiltreringen ved 15 000 ganger g i 15 minutter ved fire grader Celsius og samle supernatanten i polykarbonat ultracentrifugation rør. Sentrifuger supernatanten ved 100 000 ganger g i to timer ved fire grader Celsius.Deretter fjerner du de overnaturante og gjenbruker de membranøse pellets i totalt en milliliter steril PBS ved skånsom pipettering. Bland 0,5 milliliter av pelletsopphenget med 1,5 milliliter 60 % iodiksanoloppløsning på bunnen av et polypropylen tynt inngjerdet ultracentrifugerør. Overlegg denne MVE iodixanol 45% suspensjon med en milliliter på 40% 35% 30% 25%og 20% iodixanol løsninger og en milliliter PBS på toppen.Sentrifuge på 100, 000 ganger g for 18 timer ved fire grader Celsius. Deretter bruker du en en milliliter Hamilton sprøyte for å samle en milliliter tetthet gradient fraksjoner starter fra toppen. Fortynn hver oppsamlede brøkdel til 20 milliliter med PBS og sentrifuge ved 100 000 ganger g i to timer ved fire grader Celsius.Fjern den overnaturlige og gjenbruk i 0,5 milliliter PBS. Oppbevar rørene ved fire grader Celsius. For å utføre membranlipidanalyse, kombiner 10 mikroliter av hver gradientfraksjon med den fluorescerende membransonden TMA-DPH ved en endelig konsentrasjon på ett mikrogram per milliliter i 50 mikroliter PBS i hver brønn av en 96-brønns svart plate.Inkuber platene ved 33 grader Celsius i 20 minutter. Mål fluorescensen ved 360 nanometer for eksitasjon og 430 nanometer for utslipp. I denne protokollen ble MEVs renset ved differensialsedimentering i en tetthetsgradient.Under de forholdene som er beskrevet, ble MEVs separert hovedsakelig i gradientfraksjon tre som tilsvarer 25% iodixanol. Vesikkel-assosierte proteiner var konsentrert i brøkdel tre vist ved dot blot analyse. Negativ farging bekreftet også tilstedeværelsen av MEVs i brøkdel tre og nanopartikkelanalyse viste at størrelsen på MEV var rundt 100 nanometer.Protein- og lipidkonsentrasjon normalisert til kolonidannende enheter viste en omtrent åttedobling av MEV-utbyttet i lavt jern i forhold til høye jernforhold. Dot blot analyse viste et mer intenst signal fra MEV-tilknyttede markører i tetthet gradient fraksjoner fra jern begrenset MTB kultur enn fra jern tilstrekkelig MTB kulturer. Følg instruksjonene for fremstilling av det minimale mediet for å sikre jernbegrensede forhold og forhindre forurensning av membran vesikler med lipoproteinaggregater.Mykobakterielle membran vesikler renset på denne måten kan brukes til biokjemisk karakterisering og funksjonell analyse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analyse av epitelisk skade produsert av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infeksjon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Forenklede menneske Nøytrofile Ekstracellulære Traps (NET) Isolasjon og håndtering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Isolering og karakterisering av nøytrofiler med anti-tumor egenskaper

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolasjon og Flowcytometriske Karakterisering av Murine Small Intestinal Lymfocytter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler ved Imaging flowcytometrisystemer: En sammenligning mellom to Monocyte Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk Karakterisering av makrofager fra Rat Nyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flow Virometry å analysere Antigen Spectra av Virioner og ekstracellulære vesikler

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering og karakterisering rensing av makrofager fra vev av fedme-relaterte betennelse

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering og karakterisering av nøytrofile-avledet Microparticles for funksjonell studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering og karakterisering av ekstracellulære blemmer fra voksen Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...