Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
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Somos gratos a Rafael Prados-Rosales por compartilhar o anti-MEV antisera e Navneet Dogra para a realização de análise de rastreamento de nanopartículas.

1. Preparação do meio definido empobrecido em ferro
<ol><li>Prepare 1 L de médio mínimo (MM) dissolvendo 5 g de KH2PO4, 5 g de L-asparagine, 20 mL de glicerol e 2 g de dextrose em 900 mL de água desionizada em um recipiente de plástico. Evite o vidro para evitar a contaminação por ferro. Ajuste o pH para 6,8 com 5 N NaOH e o volume para 1 L com água.</li>
	<li>Adicione 50 g de resina quelante de metal (MCR) e agita-se suavemente usando uma barra de agitação magnética por 24 h a 4 °C. ...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

Vários métodos para purificar exossomos derivados de células eucarióticas foram desenvolvidos12. Em contraste, há informações limitadas sobre métodos eficazes para purificar EVs derivados de bactérias7. O isolamento eficiente dos EVs derivados de Mtb precisa considerar as dificuldades intrínsecas no crescimento dessa micobactéria patogênica. Mtb tem um longo tempo de divisão (~ 24 h) e deve ser tratado em condições de nível de biossegurança três (BSL-3). P...

As vesículas extracelulares micobacterianas (MEVs) são nanopartículas ligadas à membrana, de 60 a 300 nm de tamanho, naturalmente liberadas por micobactérias de crescimento rápido e lento1. Mevs liberados por micobactérias patogênicas constituem um mecanismo para interagir com o hospedeiro através de proteínas imunologicamente ativas, lipídios e glicolipides secretados de forma concentrada e protegida2,3,4. Para caracterizar MEVs e compreender a sua biogênese e funções, métodos rigorosos e eficientes de purificação e validação de vesículas são cruciais. Até agora, mevs foram isolados da cultura filtrates de micobactérias cultivadas em um meio rico em ferro1,5,6,7,8.
No entanto, trabalhos anteriores demonstraram que a limitação de ferro estimula muito a liberação de vesículas em Mtb, possivelmente para capturar ferro via micobactina, um sideróforo secretado em MEVs9. Embora os procedimentos para o isolamento de MEVs de Mtb cultivados em médio de alto ferro tenham sido descritos, uma metodologia eficiente para obter MEVs de culturas de baixo ferro não foi relatada. Portanto, o objetivo deste método é isolar, purificar e quantificar os MEVs obtidos de culturas de baixo ferro para que possam ser usados para ensaios bioquímicos e funcionais e para a análise de determinantes genéticos da produção de vesículas em micobactérias.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

Micobactérias, incluindo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose humana, liberam naturalmente vesículas extracelulares (EVs) contendo moléculas imunologicamente ativas. O conhecimento sobre os mecanismos moleculares da biogênese vesícula, o conteúdo das vesículas e suas funções na interface patógeno-hospedeiro é muito limitado. Abordar essas questões requer procedimentos rigorosos para isolamento, purificação e validação de EVs. Previamente, a produção do vesicle foi encontrada para ser realçada quando a tuberculose de M. foi expor à limitação do ferro, uma circunstância encontrada por Mtb no ambiente do anfitrião. Apresentado aqui é um protocolo completo e detalhado para isolar e purificar EVs de micobactérias deficientes em ferro. Métodos quantitativos e qualitativos são aplicados para validar EVs purificados.

Os MEVs foram purificados por sedimentação diferencial em um gradiente de densidade (Figura 1, Figura 2). Nas condições descritas, os MEVs se separaram principalmente na fração de gradiente 3 (F3), o que corresponde a 25% de iodixanol. Esta conclusão baseia-se na detecção de proteínas, lipídios de membrana, visualização microscópica de MEVs intactos, distribuição de tamanho de nanopartículas e reatividade positiv...

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Este método permite cultivar Mycobacterium tuberculosis sob estritas condições de ferro baixo e purificar vesículas de membrana a partir do filtrado de cultura de baixo ferro. Como a limitação do ferro é conhecida por estimular a produção de vesículas de membrana, este protocolo produz alta abundância de vesículas de membrana pura que podem ser utilizadas para outros ensaios bioquímicos ou funcionais. Quando demonstramos o protocolo usando o Mycobacterium smegmatis, a cepa não virgem, este protocolo pode ser seguido em instalações BSL-2 usando Mycobacterium tuberculosis, a cepa virulenta.Para começar, prepare um litro de meio mínimo dissolvendo cinco gramas de fosfato monopotássio, cinco gramas de L-asparagine, 20 mililitros de glicerol e dois gramas de dextrose em 900 mililitros de água desionizada em um recipiente plástico. Ajuste o pH para 6,8 com cinco hidróxido de sódio normais e ajuste o volume para um litro com água deionizada. Em seguida, adicione 50 gramas de resina de quesina metálica e agitar suavemente usando uma barra de agitação magnética por 24 horas a quatro graus Celsius.No dia seguinte, pare a agitação e deixe o sedimento de resina por cerca de 30 minutos. Esterilize e remova a resina restante da solução através de uma unidade de filtro de 22 mícrons com um receptor plástico. Agora, suplemente o meio mínimo com 0,5 miligramas por litro de cloreto de zinco, 40 miligramas por litro de sulfato de magnésio e 0,1 miligramas por litro de sulfato de manganês.Inocular uma única colônia de MTB em dois mililitros de caldo micobacteriano complementado com enriquecimento ADN. Incubar com agitação a 37 graus Celsius. Quando houver crescimento visível, extraia dois mililitros da cultura e mede o OD 540 em um espectógrafo.Pare a incubação quando o OD 540 atingir 0,8, o que indica a fase logarítmica tardia. Espalhe 200 microlitadores da cultura logarítmica tardia nas placas de ágar micobacteriano suplementadas com 0,2 glicerol, 0,5% Tween 80 e ADN. Inocular pelo menos cinco pratos.Incubar as placas a 37 graus Celsius. E depois de uma semana, o crescimento bacteriano é visível como uma camada confluente. Em seguida, molhe um cotonete estéril em um meio mínimo de ferro baixo.Use este cotonete para coletar bactérias das placas de ágar. Inocular a bactéria em 100 mililitros de baixa mídia de ferro mínimo em um tubo. Colete bactérias suficientes para preparar uma suspensão com um OD 540 de um.Diluir a suspensão 10 vezes para um litro com meio mínimo de ferro baixo e dividi-la em duas garrafas plásticas estéreis. Em seguida, transfira dois mililitros da cultura para um tubo de cultura de cinco mililitros. Adicione 10 microliters de 10% de volume por volume tyloxapol.Incubar as culturas a 37 graus Celsius por 14 dias. Transfira a cultura para cinco tubos de centrífuga cônica de 225 mililitros e centrífuga a 2.850 vezes g por sete minutos a 20 graus Celsius. Colete a supernascercultura cultural com uma pipeta de 50 mililitros e esterilize-a através de um filtro de 0,22 mícrons.Para isolar os MEVs, transfira o filtrado da cultura para um sistema de ultrafiltração celular agitado colocado a quatro graus Celsius e filtre o concentrado a uma pressão inferior a 50 PSI através de uma membrana de corte de 100 kilodalton. Em seguida, centrifugar a cultura concentrada filtrar a 15.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius e coletar o supernascido em tubos de ultracentrifugação de policarbonato. Centrifugar o supernante a 100.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius.Depois disso, remova o supernaspe e resuspenda as pelotas membranous em um total de um mililitro de PBS estéril por tubulação suave. Misture 0,5 mililitros da suspensão da pelota com 1,5 mililitros de solução de 60% iodixanol na parte inferior de um tubo ultracentrifuge de parede fina de polipropileno. Sobreponha esta suspensão de Iodixanol MVE de 45% com um mililitro de 40%35%30%25% e 20% de soluções iodixanol e um mililitro de PBS no topo.Centrifugar a 100.000 vezes g por 18 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, use uma seringa Hamilton de um mililitro para coletar as frações de gradiente de densidade de um mililitro a partir do topo. Diluir cada fração coletada para 20 mililitros com PBS e centrífuga a 100.000 vezes g por duas horas a quatro graus Celsius.Remova o supernatante e resuspend em 0,5 mililitros de PBS. Armazene os tubos a 4 graus Celsius. Para realizar a análise lipídica da membrana, combine 10 microliters de cada fração gradiente com a sonda de membrana fluorescente TMA-DPH em uma concentração final de um micrograma por mililitro em 50 microlitrais de PBS em cada poço de uma placa preta de 96 poços.Incubar as placas a 33 graus Celsius por 20 minutos. Meça a fluorescência em 360 nanômetros para excitação e 430 nanômetros para emissão. Neste protocolo, os MEVs foram purificados por sedimentação diferencial em um gradiente de densidade.Nas condições descritas, os MEVs foram separados principalmente na fração de gradiente três, o que corresponde a 25% de iodixanol. As proteínas associadas à vesícula foram concentradas na fração três mostrada pela análise da mancha de ponto. A coloração negativa também confirmou a presença de MEVs na fração três e a análise de nanopartículas mostrou que o tamanho do MEV era de cerca de 100 nanômetros.A concentração de proteínas e lipídios normalizada para unidades formadoras de colônias mostrou um aumento de aproximadamente oito vezes no rendimento de MEV em ferro baixo em relação às altas condições de ferro. A análise da mancha de ponto mostrou um sinal mais intenso de marcadores associados ao MEV em frações de gradiente de densidade da cultura MTB limitada de ferro do que de culturas MTB suficientes de ferro. Siga as instruções para a preparação do meio mínimo para assegurar condições limitadas de ferro e evitar a contaminação das vesículas da membrana com agregados de lipoproteína.As vesículas da membrana micobacteriana purificadas desta forma podem ser utilizadas para caracterização bioquímica e análise funcional.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

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Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

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Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

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Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Fluxo Virometry para analisar antigênica Spectra de viriões e Extracelular vesículas

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Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

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Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...