Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Мы благодарны Рафаэлю Прадос-Росалесу за то, что он поделился антисерой антисеры МИВ и Навнитом Догра за выполнение анализа отслеживания наночастиц.

1. Подготовка истощенного железом определяемого среднего
<ol><li>Приготовьте 1 л минимальной средней (ММ) путем растворения 5 г KH2PO4,5 г L-аспарагина, 20 мл глицерола и 2 г декстроза в 900 мл деионизированной воды в пластиковом контейнере. Избегайте стекла, чтобы предотвратить загряз?...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

Несколько методов для очистки эукариотических клеток, полученных экзосомы были разработаны12. В отличие от этого, существует ограниченная информация об эффективных методах очистки бактерий полученных EVs7. Эффективная изоляция Mtb-полученных EVs необходимо учиты...

Микобактериальные внеклеточные пузырьки (MEV) являются мембранными наночастицами, размером 60-300 нм, естественно выделяемых быстро- и медленно растущими микобактериями1. МЕВ, высвобождаемые патогенными микобактериями, представляют собой механизм взаимодействия с хозяином с помощью иммунологически активных белков, липидов и гликолипидов, выделяемых концентрированным и защищенным образом2,3,4. Для характеристики МЭВ и понимания их биогенеза и функций, строгие и эффективные методы очистки везикулы и проверки имеют решающее значение. До сих пор, MEVs были изолированы от культуры фильтратов микобактерий, выращенных в богатых железом среде1,5,6,7,8.
Тем не менее, предыдущая работа показала, что ограничение железа значительно стимулирует высвобождение везикля в Mtb, возможно, для захвата железа с помощью микобактина, siderophore выделяется в MEVs9. Хотя процедуры изоляции МЭВ от Mtb, культивированные в высокой железной среде, были описаны, эффективной методологии получения МЭВ из низкой культуры железа не сообщалось. Таким образом, цель этого метода состоит в том, чтобы изолировать, очистить и количественно MEVs, полученные из низких культур железа, так что они могут быть использованы для биохимических и функциональных анализов и для анализа генетических детерминантов везиклов производства в микобактериях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

Микобактерии, в том числе Микобактерии туберкулеза (МТБ), возбудителя туберкулеза человека, естественным образом высвобождают внеклеточные пузырьки (ЭВ), содержащие иммунологически активные молекулы. Знания о молекулярных механизмах везиклового биогенеза, содержании пузырьков и их функциях при патогенно-хост-интерфейсе очень ограничены. Решение этих вопросов требует строгих процедур для изоляции, очистки и проверки EVs. Ранее было установлено, что производство везикл было увеличено, когда М. туберкулез подвергался воздействию ограничения железа, состояние, с которым сталкивается Mtb в принимающей среде. Представлен полный и подробный протокол для изоляции и очистки EVs от железодефицитных микобактерий. Количественные и качественные методы применяются для проверки очищенных ЭВ.

MEV были очищены дифференциальной осадок в градиент плотности(Рисунок 1, Рисунок 2). В описанных условиях, MEVs разделены главным образом в градиентной фракции 3 (F3), который соответствует 25% йодиксанол. Этот вывод основан на обнаружении белк?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Микобактерия туберкулеза показывает увеличение производства и высвобождение внеклеточных пузырьков в ответ на низкие железные условия. Эта работа детали протокола для генерации низких железных условий и методов для очистки и характеристики микобактериальных внеклеточных пузырьков, выпущенных в ответ на дефицит железа.

Изоляция и характеристика внеклеточных пузырьков, производимых железо-ограниченным имикобактериями

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Этот метод позволяет культивировать микобактерии туберкулеза в строгих условиях низкого железа и очищать мембранные пузырьки от фильтрата низкой железной культуры. Поскольку ограничение железа, как известно, стимулирует производство мембранных пузырьков, этот протокол дает высокое изобилие чистых мембранных пузырьков, которые могут быть использованы для дальнейших биохимических или функциональных анализов. Когда мы демонстрируем протокол с использованием Mycobacterium smegmatis, невирулянтного штамма, этот протокол может следовать в учреждениях BSL-2 с использованием микобактерий туберкулеза, вирулентного штамма.Для начала приготовьте один литр минимальной среды, растворив пять граммов монопотассиума фосфата, пять граммов L-аспарагина, 20 миллилитров глицероля и два грамма декстрозы в 900 миллилитров деионизированной воды в пластиковой таре. Отрегулируйте рН до 6,8 с пятью нормальными гидроксидами натрия и отрегулируйте объем до одного литра с деионизированной водой. Затем добавьте 50 граммов металлической хелатной смолы и аккуратно агитигитив с помощью магнитного батончика в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия.На следующий день, остановить перемешивание и пусть смолы осадок около 30 минут. Стерилизовать и удалить оставшуюся смолу из раствора путем фильтрации через блок фильтра 22 микрона с пластиковым приемником. Теперь дополните минимальную среду 0,5 миллиграммами на литр хлорида цинка, 40 миллиграммами на литр сульфата магния и 0,1 миллиграмма на литр сульфата марганца.Привить одну колонию МТБ в два миллилитров микобактериального бульона среды, дополненной обогащением ADN. Инкубация с возбуждением при 37 градусах по Цельсию. Когда есть видимый рост, извлечь два миллилитров культуры и измерить OD 540 на спектрофотометре.Остановите инкубацию, когда OD 540 достигнет 0,8, что указывает на поздную логаритмическую фазу. Распространение 200 микролитров поздней логаритмической культуры на микобактериальные агарные пластины, дополненные 0,2 глицеролом, 0,5%Tween 80 и ADN. Прививать не менее пяти пластин.Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию. И через неделю рост бактерий виден как стечение слоя. Затем промокнуть стерильный ватный тампон в низкой железа минимальной среде.Используйте этот тампон для сбора бактерий из агар пластин. Прививка бактерий в 100 миллилитров низкого железа минимальных средств массовой информации в трубке. Соберите достаточное количество бактерий, чтобы подготовить подвеску с OD 540 одного.Разбавить подвеску 10 раз до одного литра с низким содержанием железа минимальной среде и разделить его на две стерильные пластиковые бутылки. Затем перенесите два миллилитров культуры в пятими миллилитровую культурную трубку. Добавьте 10 микролитров объемом 10% по объему тилоксаполя.Инкубировать культуры при 37 градусах по Цельсию в течение 14 дней. Перенесите культуру на пять 225 миллилитров конических центрифуг и центрифуг при 2, 850 раз г в течение семи минут при 20 градусах по Цельсию. Соберите супернатант культуры с помощью 50-миллилитровой пипетки и процберите ее через фильтр 0,22 микрона.Чтобы изолировать MEV, перенесите филтрат культуры в перемешиваемую систему ультрафильтрации клеток, расположенную при четырех градусах Цельсия, и фильтруем концентрат под давлением менее 50 PSI через мембрану отсечения 100 килодальтонов. Затем центрифуга концентрированной культуры фильтрата на 15000 раз г в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию и собирать супернатант в поликарбонат ультрацентрифугации труб. Центрифугировать супернатант при 100 000 раз г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.После этого, удалить супернатант и повторно membranous гранулы в общей сложности один миллилитр стерильных PBS нежной пипетки. Смешайте 0,5 миллилитров подвески гранул с 1,5 миллилитров 60%йодиксанола раствора в нижней части полипропилена тонкой стеной ультрацентрифуг трубки. Наложение этого MVE йодиксанол 45%подвеска с одним миллилитр 40%35%30%25%и 20%iodixanol решений и один миллилитр PBS в верхней части.Центрифуга при 100 000 раз г в течение 18 часов при четырех градусах Цельсия. Далее используйте один миллилитр Гамильтон шприц для сбора одного миллилитра плотности градиентных фракций, начиная с самого верха. Разбавить каждую собранную фракцию до 20 миллилитров с помощью PBS и центрифуги при 100 000 раз г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.Удалите супернатант и resuspend в 0,5 миллилитров PBS. Храните трубки при четырех градусах по Цельсию. Для проведения мембранного липидного анализа объедините 10 микролитров каждой градиентной фракции с флуоресцентным мембранным зондом TMA-DPH при конечной концентрации одного микрограмма на миллилитр в 50 микролитров PBS в каждом колодец 96-ну черной пластины.Инкубировать пластины при 33 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Измерьте флуоресценцию на 360 нанометров для возбуждения и 430 нанометров для эмиссии. В этом протоколе МВВ были очищены дифференциальной осадочной установкой в градиенте плотности.В описанных условиях, MEVs были разделены в основном в градиентной фракции три, которая соответствует 25%iodixanol. Связанные с везикулом белки были сконцентрированы во фракции 3, показанной анализом точечной помарки. Отрицательное окрашивание также подтвердило наличие МЕВ во фракции три и анализ наночастиц показал, что размер МВВ составляет около 100 нанометров.Концентрация белка и липидов, нормализованная для колоний, показала примерно восьмикратное увеличение урожайности МЕВ в низком железе по сравнению с высокими условиями железа. Анализ помарки точки показал более интенсивный сигнал от MEV-связанных маркеров в фракциях градиента плотности от культуры mTB утюга лимитированную чем от культур MTB утюга достаточных. Следуйте инструкциям по подготовке минимальной среды для обеспечения железа ограниченных условий и предотвращения загрязнения мембранных пузырьков липопротеинов агрегатами.Микобактериальные мембранные пузырьки, очищенные таким образом, могут быть использованы для биохимической характеристики и функционального анализа.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Анализ ущерба эпителиальных Продюсеры<em&gt; Entamoeba гистолитика</em&gt; Инфекция

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Выделение и характеристика нейтрофилов с Противоопухолевые свойства

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Выделение и проточной цитометрии Характеристика мышиных лимфоцитах тонкого кишечника

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Характеристика человека моноцитов дендритные клетки путем обработки изображений проточной цитометрии: Сравнение между двумя моноцитов Isolation протоколов

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Фенотипическая Характеристика макрофаги почек крыс с помощью проточной цитометрии

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Поток Virometry для анализа антигенные спектры вирионов и внеклеточной везикул

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Выделение и характеристика нейтрофилов производные микрочастиц для функциональных исследований

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Изоляция и характеристика внеклеточного везикулы от взрослых Schistosoma японский

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...