Name: isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria
Uploaded: 2019-10-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Vi är tacksamma för att Rafael Prados-Rosales för att dela anti-MeV antiserum och Navneet dogra för att utföra nanopartiklar spårningsanalys.

1. beredning av Järnutarmat definierat medium
<ol><li>Bered 1 L minimalt medium (MM) genom att upplösa 5 g KH2Po4,5g L-asparagin, 20 ml glycerol och 2 g dextros i 900 ml avjoniserat vatten i en plastbehållare. Undvik glas för att förhindra järn förorening. Justera pH till 6,8 med 5 N NaOH och volymen till 1 L med vatten.</li>
	<li>Tillsätt 50 g metall kelaterande harts (MCR) och försiktigt agitera med hjälp av en magnetisk rör bar för 24 h vid 4 ° c. Sterilisera och ta bort MCR genom ...

<ol>
	<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice.">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).</li><li>Gupta, S., Rodriguez, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+extracellular+vesicles+and+host+pathogen+interactions.">Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions.</a> Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Membrane+Vesicles+Mediate+the+Release+of+Mycobacterium+tuberculosis+Lipoglycans+and+Lipoproteins+from+Infected+Macrophages.">Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages.</a> Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).</li><li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation.">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).</li><li>Rath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+vesiculogenesis+and+immunomodulation+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).</li><li>White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+tuberculosis+Pst/SenX3-RegX3+Regulates+Membrane+Vesicle+Production+Independently+of+ESX-5+Activity.">Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity.</a> mBio. 9, pii 00778 (2018).</li><li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes:+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity.">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).</li><li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria.">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li><li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+Mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquistion.">Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion.</a> Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).</li><li>Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+Laboratory+Techniques:+Plating+Methods.">Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods.</a> Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).</li><li>Harlow, E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies. A laboratory manual. , (1988).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

Flera metoder för att rena eukaryota cell-härledda exosomer har utvecklats12. Däremot finns det begränsad information om effektiva metoder för att rena bakterier som härrör EVs7. Effektiv isolering av MTB-derived EVs måste beakta de inneboende svårigheterna att odla denna patogena Mycobacterium. MTB har en lång Division tid (~ 24 h) och bör hanteras i biosäkerhet nivå tre (BSL-3) villkor. Därför är det viktigt att optimera effektiviteten hos MEV-isoleringsme...

Mykobakteriella extracellulära blåsor (MEVS) är membran-bundna nanopartiklar, 60 − 300 nm i storlek, naturligt frigörs genom snabb-och långsamt växande mykobakterier1. MEVS släpptes av patogena mykobakterier utgör en mekanism för att interagera med värden via immunologiskt aktiva proteiner, lipider, och glykolipider utsöndras i ett koncentrerat och skyddat sätt2,3,4. För att karakterisera MEVs och förstå deras biogenes och funktioner är strikta och effektiva metoder för vesikelrening och validering avgörande. Hittills har MEVS isolerats från kulturfiltrat av mykobakterier som odlas i ett järnrikt medium1,5,6,7,8.
Men tidigare arbete visat att järn begränsning kraftigt stimulerar vesikler release i MTB, möjligen för att fånga järn via mycobactin, en siderophore utsöndras i MEVs9. Även om förfaranden för MEVs isolering från MTB odlade i hög järn medium har beskrivits, en effektiv metod för att få MEVs från låga järn kulturer har inte rapporterats. Därför är målet med denna metod att isolera, rena och kvantifiera MEVs erhålls från låga järn kulturer så att de kan användas för biokemiska och funktionella analyser och för analys av genetiska bestämningsfaktorer för vesikelproduktion i mykobakterier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amicon stirred cell Model 108</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>UFSC40001</td>
			<td>Cell Ultrafiltration system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Polypropilene 225 ml conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-538-61</td>
			<td>Conical centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane</td>
			<td>EMD Milipore</td>
			<td>PBHK07610</td>
			<td>Ultrafiltration membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex-100 resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td>Metal chelating resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>262710</td>
			<td>Mycobacterial Agar plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Mycobacterial broth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro cellulose blotting membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600001</td>
			<td>Blotting Membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Iodixanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355618</td>
			<td>Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td>Polypropylene thin walled centrifuge tube 13x15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay dye</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td>Bradford Protein Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Ruby</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S12000</td>
			<td>Ultrasensitive protein stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA-DPH</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>T204</td>
			<td>1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration flasks</td>
			<td>CellPro</td>
			<td>V50022</td>
			<td>Filter Unit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria

Mykobakterier, inklusive Mycobacterium tuberculosis (MTB), smittämnen av mänsklig tuberkulos, naturligt frisättning extracellulära blåsor (EVS) som innehåller immunologiskt aktiva molekyler. Kunskap om de molekylära mekanismerna hos vesikler biogenes, innehållet i vesiklarna, och deras funktioner vid pathogen-Host-gränssnittet är mycket begränsad. Att ta itu med dessa frågor kräver rigorösa procedurer för isolering, rening och validering av EVs. Tidigare konstaterades att vesikelproduktionen förstärktes när M. tuberkulos utsattes för järn restriktion, ett tillstånd som MTB stötte på i värdmiljön. Presenteras här är ett komplett och detaljerat protokoll för att isolera och rena EVs från järn-bristfällig mykobakterier. Kvantitativa och kvalitativa metoder tillämpas för att validera renade EVs.

MEVs renas genom differential sedimentering i en densitetsgradient (figur 1, figur 2). Enligt de beskrivna villkoren separeras MEVs mestadels i gradientfraktion 3 (F3), vilket motsvarar 25% iodixanol. Denna slutsats är baserad på detektion av protein, membran lipid, mikroskopisk visualisering av intakt MEVs, nanopartikel storleksfördelning, och positiv reaktivitet med ett antivesicle antiserum (figur 2</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacterium tuberculosis visar ökad produktion och frisättning av extracellulära blåsor som svar på låga järn förhållanden. Detta arbete specificerar ett protokoll för att generera låga järn förhållanden och metoder för rening och karakterisering av mycobakteriell extracellulära blåsor som släppts som svar på järnbrist.

Isolering och karaktärisering av extracellulära blåsor som produceras av Järnbegränsade mykobakterier

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Denna metod tillåter odling Mycobacterium tuberkulos under strikta låga järnförhållanden och renande membran vesiklar från den låga järnkultur filtratet. Eftersom järn begränsning är känt för att stimulera membran vesikelproduktion, detta protokoll ger högt överflöd av rena membran vesiklar som kan utnyttjas för ytterligare biokemiska eller funktionella analyser. När vi visar protokollet med hjälp av Mycobacterium smegmatis, den nonvirulent stammen, kan detta protokoll följas i BSL-2 anläggningar med hjälp av Mycobacterium tuberkulos, den virulenta stammen.Till att börja, förbereda en liter minimalt medium genom att lösa upp fem gram monopotassiumfosfat, fem gram L-asparagin, 20 milliliter glycerol och två gram dextros i 900 milliliter av avjoniserat vatten i en plastbehållare. Justera pH-värdet till 6,8 med fem normal natriumhydroxid och justera volymen till en liter med avjoniserat vatten. Tillsätt sedan 50 gram metall kelat harts och försiktigt agitera med hjälp av en magnetisk rör bar i 24 timmar vid fyra grader Celsius.Nästa dag, stoppa omrörning och låt harts sediment i ca 30 minuter. Sterilisera och ta bort kvarvarande harts från lösningen genom filtrering genom en 22 mikron filterenhet med en plastmottagare. Nu, komplettera minimalt medium med 0,5 milligram per liter zinkklorid, 40 milligram per liter magnesiumsulfat, och 0,1 milligram per liter mangansulfat.Inokulera en enda koloni av MTB i två milliliter av mycobacterial buljong medium kompletteras med ADN anrikning. Inkubera med agitation vid 37 grader Celsius. När det finns synlig tillväxt, extrahera två milliliter av kulturen och mäta OD 540 på en spektrofotometer.Stoppa inkubationen när OD 540 når 0,8 vilket indikerar den sena logaritmiska fasen. Sprid 200 mikroliter av den sena logaritmiska kulturen på de mykobakteriella agarplattorna kompletterade med 0,2 glycerol, 0,5%Tween 80 och ADN. Inokulera minst fem plattor.Inkubera plattorna i 37 grader Celsius. Och efter en vecka syns bakterietillväxten som ett konfluent lager. Sedan våt en steril bomullspinne i ett lågt järn minimalt medium.Använd denna svabb för att samla bakterier från agarplattorna. Inokulera bakterierna i 100 milliliter låg järn minimal media i ett rör. Samla in tillräckliga bakterier för att förbereda en suspension med en OD 540 av en.Späd suspensionen 10 gånger till en liter med lågt järn minimalt medium och dela upp den i två sterila plastflaskor. Därefter överför du två milliliter av kulturen till ett fem milliliter odlingsrör. Tillsätt 10 mikroliter med 10%volymvolymvolym.Inkubera kulturerna vid 37 grader Celsius i 14 dagar. Överför kulturen till fem 225 milliliter koniska centrifugrör och centrifug vid 2, 850 gånger g i sju minuter vid 20 grader Celsius. Samla kulturen supernatant med en 50 milliliter pipett och filtrera sterilisera den genom en 0,22 mikron filter.För att isolera MEVs, överföra kulturen filtratet i en rörd cell ultrafiltreringssystem placeras på fyra grader Celsius och filtrera koncentratet vid ett tryck mindre än 50 PSI genom en 100 kilodalton cutoff membran. Sedan centrifug den koncentrerade kulturen filtratet vid 15, 000 gånger g i 15 minuter vid fyra grader Celsius och samla supernatanten i polykarbonat ultracentrifugeringsrör. Centrifugera supernatanten vid 100, 000 gånger g i två timmar vid fyra grader Celsius.Därefter tar du bort supernatanten och återanvänder de membranösa pelletsen i totalt en milliliter steril PBS genom mild pipettering. Blanda 0,5 milliliter av pelletsupphängningen med 1,5 milliliter 60%iodixanollösning i botten av ett polypropylentunnat väggigt ultracentrifugrör. Överlagra denna MVE iodixanol 45%suspension med en milliliter på 40%35%30%25%och 20%iodixanol lösningar och en milliliter PBS överst.Centrifug vid 100, 000 gånger g i 18 timmar vid fyra grader Celsius. Använd sedan en en milliliter Hamilton spruta för att samla en milliliter densitet gradient fraktioner från toppen. Späd varje uppsamlad fraktion till 20 milliliter med PBS och centrifug vid 100, 000 gånger g i två timmar vid fyra grader Celsius.Ta bort supernatanten och resuspend i 0,5 milliliter PBS. Förvara rören i fyra grader Celsius. För att utföra membranlipidanalys, kombinera 10 mikroliter av varje gradientfraktion med lysröret membransonden TMA-DPH vid en slutlig koncentration av ett mikrogram per milliliter i 50 mikroliter PBS i varje brunn av en 96-väl svart platta.Inkubera plattorna i 33 grader Celsius i 20 minuter. Mät fluorescensen vid 360 nanometer för excitation och 430 nanometer för utsläpp. I detta protokoll, MEVs renades genom differentiell sedimentering i en densitet gradient.Under beskrivna betingelser separerades MEVs mestadels i gradientfraktion tre vilket motsvarar 25%iodixanol. Vesikel-associerade proteiner var koncentrerade till fraktion tre visas av dot blot analys. Negativ färgning bekräftade också förekomsten av MEVs i fraktion tre och nanopartikel analys visade storleken på MEV var cirka 100 nanometer.Protein och lipid koncentration normaliserade till kolonin bildar enheter visade en ungefär åtta-faldig ökning av MEV avkastning i låg järn i förhållande till höga järn villkor. Dot blot analys visade en mer intensiv signal från MEV-associerade markörer i densitet gradient fraktioner från järn begränsad MTB kultur än från järn tillräcklig MTB kulturer. Följ instruktionerna för beredning av det minimala mediet för att försäkra järn begränsade förhållanden och förhindra kontaminering av membran vesiklar med lipoprotein aggregat.Den mykobakteriella membran vesiklar renas på detta sätt kan användas för biokemiska karakterisering och funktionell analys.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Analys av epitelskada Producerad av<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Förenklad Human Neutrofila Extracellulär Fällor (NET) Isolering och Hantering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Isolering och karakterisering av neutrofiler med Anti-tumöregenskaper

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolering och Flödescytometriska karakterisering av murina tunntarms lymfocyter

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från Imaging Flow Cytometry: en jämförelse mellan två monocyt Isoleringsprotokoll

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk karakterisering av makrofager från råttnjure med flödescytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flöde Virometry Analysera Antigen Spectra virioner och extracellulär Blåsor

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering, karakterisering och rening av makrofager från vävnader som påverkas av fetma-relaterade Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Isolering och karakterisering av neutrofiler-derived mikropartiklar för funktionella studier

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Isolering och karakterisering av extracellulära blåsor från Adult Schistosoma japonicum

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...