Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

وقد تم دعم S.D.O. من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة برعاية جامعه كاليفورنيا سان دييغو البحوث المؤسسية وجائزه التطوير الوظيفي الاكاديميه (المعاهد القومية للصحة/IRACDA K12 GM068524). وقد تم دعم كو من قبل معهد لودفيغ لأبحاث السرطان ، والذي قدم لهم أيضا تمويل الأبحاث المستخدمة لدعم هذا العمل. ونحن ممتنون لأندرو Chisholm لنصيحته في المراحل المبكرة من هذا المشروع ، رونالد بيجز للمساهمات في هذا المشروع بعد مرحله تطوير الأسلوب الاولي ، وديف جينكينس واندي Shiau للحصول علي الدعم والوصول إلى اكتشاف جزيء صغير نظام التصوير عالي المحتوي الخاص بالمجموعة.

1 . اعداد الاجنه الخاصة بالتصوير شبه العالي الانتاجيه
ملاحظه: والهدف من هذا الجزء من البروتوكول هو تحميل السكان من شبه متزامنة (2 إلى 8-خليه المرحلة) c. الاجنه ، تشريح من سلالات علامة مناسبه (الشكل 2) ، إلى أسفل الزجاج 384-بئر لوحه للتصوير. ويمكن أ?...

<ol>
	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

يصف هذا العمل مجموعه من الاداات والأساليب التي تم تطويرها لتمكين الجهود علي نطاق أوسع لتوصيف وظيفة الجينات في التنمية الجنينية في c. اليجينات. طريقتنا شبه عاليه الانتاجيه تسمح بالتصوير بالفاصل الزمني ثلاثي الابعاد للتطوير الجنيني بدقه 20 دقيقه لأجنه 80 – 100 في تجربه واحده. في حين ان هذا...

الجنين c. ايلينيسس هو نظام نموذجي مهم لبيولوجيا الخلية الميكانيكية وتحليل مواصفات مصير الخلية والاحداث مورفوجينيتيك قياده التنمية الجنينية1,2,3,4 ،5،6،7،8،9. حتى الآن ، تم تحقيق الكثير من توصيف كل من الاحداث علي المستوي الخلوي ومواصفات مصير الخلية في الجنين باستخدام الاستبانة الزمنيه عاليه نسبيا تجارب التصوير الواحد في الوقت (اي اقتناء كل 10-100 ثانيه) من الاجنه التعبير عن علامات الفلورسنت. وعلي الرغم من ان هذا النهج مناسب تماما للاحداث التي تقام علي ترتيب الثواني إلى عشرات الدقائق ، فانه يصبح مقيدا من الناحية التقنية لتوصيف العمليات الأطول ، علي حسب ترتيب الساعات والأيام. التنمية الجنينية من الانقسام الأول إلى نهاية استطاله يستغرق حوالي 10 ساعة. في هذا المقياس الزمني ، والطرق شبه عاليه الانتاجيه التي من شانها ان تسمح للتصوير في وقت واحد اقل دقه التصوير (اي الاستحواذ علي فترات زمنيه 5-20 دقيقه) من المجموعات الأكبر من الاجنه ، من ظروف مختلفه ، من شانه ان يفتح نطاقا جديدا من التجارب ؛ علي سبيل المثال ، تمكين جهود الفحص المنهجي علي نطاق واسع وتحليل اعداد كافيه من الاجنه للمقارنة بين عواقب الاضطرابات الجزيئية.
هنا ، ونحن وصف طريقه شبه عاليه الانتاجيه لرصد الاجنه c. التي تمكن في وقت واحد 3d التصوير الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. والبروتوكول مباشر لتنفيذه ويمكن ان يقوم به اي مختبر مع امكانيه الوصول إلى المجهر مع قدرات زيارة نقطه. وترد الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول في الشكل 1. وباختصار ، يتم تشريح الاجنه من البالغين الذين يعبرون عن علامات الفلورسنت المثيرة للاهتمام ونقل الاجنه الشابة (2 – 8 خلايا المرحلة) إلى الآبار من لوحه 384 البئر للتصوير. وفي هذا الشكل ، فان حجم البئر الصغير نسبيا يدخل الاجنه في منطقه ضيقه ، مما يسهل تحديد الحقول التي تحتوي علي أجنه متعددة للتصوير بالفواصل الزمنيه. للحفاظ علي التطور متزامن تقريبا عبر مجموعه من الاجنه ، يتم تنفيذ التفكيك في وسائل الاعلام المبردة ويتم عقد لوحه علي الجليد ، والذي يمنع تطورا كبيرا خلال النافذة وقت التشريح ساعة طويلة. يتم نقل لوحه إلى المجهر ويتم تصوير الاجنه في غرفه التي تسيطر عليها درجه الحرارة بين عشيه وضحيها ، في 20 فتره زمنيه دقيقه ، وذلك باستخدام 60x الغمر النفط 1.35 NA عدسه ، لجمع الكامل z-المدى في 2 ميكرومتر الخطوات. 50 الحقول التي تحتوي علي ما بين 1 إلى 5 أجنه ، والتي يتم تصويرها في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. اعتمادا علي التجربة المطلوبة ، يمكن زيادة دقه الوقت (علي سبيل المثال ، التصوير بفواصل زمنيه تتراوح بين 5 و 10 دقائق) من خلال تقليل عدد الحقول التي لم يتم الحد منها بشكل تناسبي.
مع هذا البروتوكول ، حتى الشوط الواحد بين عشيه وضحيها يولد كميه كبيره من البيانات (80-100 الاجنه موزعه علي 50 الحقول) والتجارب الكبيرة يمكن ان تصبح بسرعة لا يمكن السيطرة عليها فيما يتعلق بتحليل البيانات. لتسهيل المعالجة والتصور وتبسيط تحليل هذه البيانات ، تم بناء برنامج لاقتصاص وتوجيه الاجنه وتنفيذ خطوات المعالجة المسبقة (اختياري) ، وماكرو ImageJ الذي يجمع البيانات لتبسيط العرض. ويمكن استخدام هذه البرامج لمعالجه الصور التي تم جمعها باستخدام النهج التقليدية ، لأنها مستقله عن طريقه التصوير ، وتتطلب فقط طائره واحده من الحقول الساطعة. البرنامج الأول ياخذ في حقل 4D التي تحتوي علي الاجنه متعددة (GUI الخيار أو رمز المصدر embryoCrop.py) أو حقول 4D متعددة تحتوي علي الاجنه متعددة (screenCrop.py) ، والمحاصيل باحكام الاجنه ويوجه لهم في التكوين الخلفي الامامي. كما تمنح هذه البرامج المستخدمين خيار اجراء الطرح الخلفي وتصحيح الانحراف وتصحيح التوهين. الملفات الناتجة هي بشكل موحد قبل المعالجة ، مكدسات tiff اقتصاص باحكام لكل جنين التي هي قابله للتعديل إلى تحليل الصور الألى. لجعله ابسط لعرض جميع الاجنه لكل شرط ، وقد كتب ماكرو ImageJ (OpenandCombine_embsV2) ، الذي يجمع كل الاجنه من حاله معينه في كومه tiff واحده والصور والمصفوفات برايت الحقل الأقصى الإسقاط كثافة اللون ( RGB) تراكبات ، جنبا إلى جنب ، لكل جنين. تم التحقق من صحة الأساليب باستخدامها لتوصيف التنمية الجنينية بعد ضرب من 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا في زوج من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للطبقة الجرثومية مواصفة و [مورفوجنسيس]10,11. ومعا ، فان بروتوكول تصوير الاجنه شبه العالية وأداات معالجه الصور ستمكن من اجراء التجارب علي عدد أكبر من العينات وجهود الفرز الواسعة النطاق الرامية إلى فهم العمليات التنموية. الاضافه إلى ذلك ، ستوفر هذه السلالات أيضا وسيله فعاله لفحص اثار الاضطرابات الجزيئية علي الاجنه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

C. اليجايليس هو النظام الرئيسي للتحليل المنهجي لمواصفات مصير الخلية والاحداث الوراثية اثناء النمو الجنيني. ويتمثل أحد التحديات في ان الاجنه تتكشف ديناميكيا علي مدي فتره تبلغ حوالي 13 ساعة ؛ وقد ادي هذا المقياس الزمني الذي دام نصف يوم إلى تقييد نطاق التجارب من خلال الحد من عدد الاجنه التي يمكن ان تكون غير محدده العمر. هنا ، ونحن وصف بروتوكول شبه عاليه الانتاجيه التي تسمح للتصوير في وقت واحد 3D الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه في وقت معتدل القرار ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. البروتوكول هو واضح ويمكن تنفيذها من قبل اي مختبر مع الوصول إلى المجهر مع نقطه القدرة علي الزيارة. ويتجلى الفائدة من هذا البروتوكول باستخدامه لصوره اثنين من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للمواصفات الجرثومية طبقه ونشاه المستنقعات. لتحليل البيانات ، تم بناء برنامج مخصص يقوم باقتصاص الاجنه الفردية من مجال عرض أوسع في جميع القناات ، والخطوات z ، والنقاط الزمنيه ، ويحفظ المتواليات لكل جنين في كومه tiff منفصلة. وهذا البرنامج ، الذي يتضمن واجهه مستخدم رسوميه سهله الاستخدام (GUI) ، يبسط معالجه البيانات عن طريق العزل ، والمعالجة المسبقة ، وتوجيه الاجنه الفردية بشكل موحد استعدادا للتصور أو التحليل الألى. كما يتم توفير ماكرو ImageJ الذي يقوم بتجميع بيانات الجنين الفردية في ملف متعدد اللوحات يعرض الحد الأقصى من الإسقاطات الفلورية وصور الحقول الساطعة لكل جنين في كل نقطه زمنيه. تم التحقق من صحة البروتوكولات والاداات الموصوفة هنا باستخدامها لتوصيف النمو الجنيني بعد ضرب 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا. هذا التحليل تصور الأنماط الظاهرية التنموية المشروحة سابقا وكشفت عن أخرى جديده. وباختصار ، فان هذا العمل يفصل طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه إلى جانب برنامج الاقتصاص وأداه التصور ImageJ التي ، عندما يقترن مع سلالات التعبير عن علامات الفلورسنت المعلوماتية ، يسرع إلى حد كبير التجارب لتحليل النمو الجنيني.

تحديا كبيرا في توصيف تاثير الاضطرابات الجزيئية علي التنمية الجنينية c. هو ان يستغرق حوالي 10 ساعة للجنين للتقدم من الانقسام الأول إلى نهاية استطاله في 20 °16. والطريقة شبه العالية الانتاجيه التي يمكن فيها لمجموعات كبيره من الاجنه ان تكون في نفس الوقت مفيده للاحداث علي هذا ال...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

يستغرق تكوين الجنين C.elegans حوالي 13 ساعة ، وعادة ما يتم رصده عن طريق تصوير جنين واحد في كل مرة. ومع ذلك، يسمح بروتوكولنا بتصوير الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد المتزامن بين 80 و100 جنين. القدرة على جمع البيانات لأعداد كبيرة من الأجنة C.elegans النامية يفتح مجموعة جديدة من التجارب، بما في ذلك التحليل الكمي للأحداث التنموية والشاشات على نطاق واسع.ويمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لالتقاط عمليات النمو المختلفة أو لتصوير الأجنة التي تعبر عن أي مزيج من العلامات في الأنسجة ذات الاهتمام. من الصعب تفريق الأجنة بشكل صحيح داخل الآبار. وينبغي أن تكون قريبة من بعضها البعض لتمكين التقاط أجنة متعددة في كل حقل دون تكتل في طائرات Z مختلفة.نوصي باستخدام اثنين من الباحثين لتشريح جنبا إلى جنب، على الجليد، وحجب الآبار غير المستخدمة. وسوف نظهر أيضا بعض الحيل المفيدة لسرعة إعداد لوحة 384-جيدا على مراحل. تبدأ عن طريق ختم لوحة 384-جيدا ذات القاع الزجاجي مع رقائق لاصقة PCR لإخفاء الآبار غير المستخدمة.استخدام شفرة الحلاقة أو مشرط لقطع بعيدا احباط لفضح مجموعة فرعية من الآبار للاستخدام. إضافة 70 ميكرولترات من TMHC أعدت حديثا في كل بئر والحفاظ على لوحة على الجليد. استبعاد الصفين الخارجيين من اللوحة لمنع تأثيرات الحافة.لإعداد العينة السريعة، ينصح بتشريح جنباً إلى جنب من قبل باحثين اثنين. عندما تم مطلي كل من الحل، واستخدام ملاقط غرامة ومجهر تشريح لنقل حوالي 10 البالغين الجرافيد إلى 150 ميكرولترات من الجليد الباردة TMHC الحل داخل شريحة الاكتئاب واحد لكل حالة. باستخدام الملاقط والمشرط، تشريح الديدان لإطلاق الأجنة وتحميل ماصة شعرية سحبت في طامح الفم.استخدمي ماصة الفم لنقل كل أجنة المرحلة من اثنين إلى ثماني خلايا إلى آبار فردية من الصفيحة المعدة وفحص اللوحة للتأكد من عدم وجود مجاميع داخل أي آبار. عندما يتم جمع جميع الأجنة، قم بتسوية العينات عن طريق الطرد المركزي واستخدم مسح الإيثانول المنقوع لإزالة أي بقايا من قاع اللوحة. ضع اللوحة في حامل لوحة المجهر confocal مجهزة بيئه تحكمها في درجة الحرارة واستخدم الهدف 10X لإجراء مسح مسبق لكل بئر لتحديد الحقول مع أجنة مناسبة.في نهاية الفحص، قم بالتبديل إلى الهدف 60X، وضبط المستوى البؤري عند كل نقطة إلى صورة حقل إلى أربعة حقول في البئر والحصول على 18 Z-الأقسام على فترات ميكرومترية كل 20 دقيقة لمدة 10 ساعات. عندما تم الحصول على جميع الصور ، وإجراء مسح منخفض ، كامل brightfield ، ما يقرب من 20 إلى 24 ساعة بعد بدء التصوير بين عشية وضحاها لتقييم الفتك الجنيني. لاقتصاص الآلي باستخدام جنينCropUI التنفيذي، أولا تحميل البرنامج من Zenodo و testfiles.الرمز البريدي لتحديد ما إذا كان البرنامج يعمل بشكل صحيح على النظام الأساسي. مرة واحدة تحميل، بفك وانتقل إلى العثور على ملف قابل للتنفيذ embryoCropUI وانقر نقرا مزدوجا لإطلاق البرنامج. حدد فتح لتحميل حقل عرض 4D المحدد الأول للحصد.عند اقتصاص سلسلة TIFF مع أبعاد متعددة تحميل الصورة الأولى فقط في السلسلة داخل المجلد. عند تحميل كافة الصور تحديد معلمات التصوير، حدد الطرح الخلفية وتصحيح التوهين، وتعيين ترتيب مجموعة الصور والميكرنات لكل بكسل. ثم حدد تشغيل، سيتم إنشاء قص مجلد فرعي جديد يسمى في نفس المسار مثل المجلد غير المُنقط وسيتم حفظ الإصدارات المقتصة في هذا الموقع.للتصور، تحميل البرنامج المساعد MSV2 ImageJ مفتوحة ومدمجة وتعليمات واجهة المستخدم الرسومية Zenodorepov2. docx من زنودو وفتح البرنامج المساعد في IMageJ. حدد موقع الأسطر ثلاثة وأربعة وإدخال الموقع الذي سيتم تخزين مجلدات الصور فيه بعد الاقتصاص.أسماء مجلد الصور للشروط التي سيتم معالجتها، ومعرف أبجدي رقمي فريد لكل تجربة ليلية. عند إدخال كافة المعلومات، انقر فوق تشغيل. ستظهر نافذة ستقوم بتشغيل مطالبة بالانتقال إلى المجلد الخارجي الذي يحتوي على مجلدات الصور التي تم اقتصاصها.بمجرد تحديد نافذة أخرى سوف تظهر والتي سوف تسمح مواصفات المعلمات التصوير. انقر فوق "حسناً". سيبدأ الملف المركب في التجميع.عند إنشاء المركب، راجع الملفات التي يتم تركها مفتوحة. عندما صورت في سلالات مراسل مخصص جنبا إلى جنب توفير قراءات مفيدة لمعظم الأحداث التنموية الكبرى. بما في ذلك مواصفات كبريتات، التشابك الظهرية، الضميمة البشرة، الممدة، والنشوء العصبي.بعد 24 ساعة من الحقن هو الوقت الأمثل للتصوير. اعتبارا من هذا الوقت استنفاد البروتين الأمومي وتثبيط التعبير الجيني الزيجوتيك كلاهما فعالة تسفر عن متميزة، والأنماط الظاهرية التوقيع استنساخها للغاية عبر مجموعة واسعة من الجينات المشاركة في مواصفات كبريتات وmorphogenesis. من المهم أن يكون المريض أثناء تشريح والخطوات اختيار الجنين.والتقليل من التكتل واختيار المعطيات البؤرية المناسبة أمران أساسيان أيضاً لضمان جودة البيانات. يمكن تنفيذ بروتوكول لدينا مع مجموعة متنوعة من سلالات علامة الفلورسنت و بالاشتراك مع RNAi أو المسوخ. تسمح أدوات المعالجة لدينا بتحليل البيانات المبسط أو الآلي أو اليدوي.باستخدام السلالات، والأساليب، والأدوات الموصوفة هنا، قامت مجموعتنا بإجراء شاشة محتوى عالي قائم على RNAi تستهدف ما يقرب من 2000 جينات مطلوبة للتنمية الجنينية. كانت طرق الإنتاجية شبه عالية ضرورية لهذا المشروع.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

التصور والتحليل الكمي من الأوعية الدموية الجنينية في<em&gt; زينوبوس تروبيكاليس</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...