Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O.得到了美国国家普通医学研究所赞助，加州大学圣地亚哥分校机构研究和学术职业发展奖（NIH/IRACDA K12 GM068524）。A.D.和K.O.得到了路德维希癌症研究所的支持，该研究所也为他们提供了用于支持这项工作的研究资金。我们感谢安德鲁·奇斯霍尔姆在这个项目的早期阶段的建议，罗纳德·比格斯在最初方法开发阶段后为这个项目做出了贡献，戴夫·詹金斯和安迪·肖为小分子发现提供支持和访问组的高含量成像系统。

1. 为半高通量成像准备C. elegans胚胎
注：该协议的这一部分的目标是将半同步（2至8细胞阶段）的C.elegans胚胎（从合适的标记菌株（图2）解剖到玻璃底384孔板中进行成像。其他板格式也可以工作，但384孔板是首选，因为小井大小限制胚胎传播到相对较小的区域，这有利于识别含有多个胚胎的场进行延时成像。大致同步胚胎可确保?...

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这项工作描述了一套工具和方法，开发，使更大规模的努力，以分析基因在胚胎发育在C.elegans的功能。我们的半高通量方法允许在一次实验中以 20 分钟分辨率对胚胎发育进行 3D 延时成像，用于 80-100 个胚胎。虽然此协议可以适用于任何所需的标记菌株，但此工作演示了使用两种定制菌株来监测胚胎生成过程中事件的方法的潜力：（1） 胚层报告菌株，其中组织特定启动子驱动荧光组蛋白的?...

胚胎是机械细胞生物学的重要模型系统，分析细胞命运规范和形态遗传事件，推动胚胎发育1、2、3、4，5，6，7，8，9。 迄今为止，胚胎中细胞级事件和细胞命运规范的大部分特征都是通过相对高的时间分辨率一次进行成像实验（即每10-100s采集一次）表达的胚胎来实现的。荧光标记。尽管这种方法非常适合从秒到几十分钟的事件，但这种方法在技术上对较长过程的特征进行了限制，从小时到天的顺序。从第一次裂解到伸长结束的胚胎发育大约需要10小时。在这个时间尺度，半高通量的方法，将允许同时降低时间分辨率成像（即，在5-20分钟的时间间隔获得）更大的胚胎组，从不同的条件，将开辟一个新的实验范围;例如，进行系统的大规模筛选工作，并分析足够数量的胚胎，以便比较分子扰动的后果。
在这里，我们描述了一种半高通量方法，用于监测C.elegans胚胎的产生，该方法可在一次夜间运行中，在80-100个胚胎中同时进行3D延时成像，从多达14个不同的条件下进行发育。该协议易于实施，任何实验室都可以使用具有点访问功能的显微镜进行操作。此协议中的主要步骤如图1所示。简而言之，胚胎从表达荧光标记的幼体成人中解剖，并将年轻胚胎（2-8细胞阶段）转移到384孔板的孔中进行成像。在这种形式下，相对较小的井尺寸将胚胎漏斗到狭窄的区域，这有助于识别含有多个胚胎的场，以便进行延时成像。为了保持胚胎群的大致同步发育，解剖在冷冻介质中进行，板在冰上保存，这阻止了长达一小时的解剖时间窗口的重大发育。将板转移到显微镜上，胚胎在温度控制室中过夜，间隔20分钟，使用60倍油浸1.35 NA透镜，在2μm步数中收集整个z-范围。50个场，每个包含1-5个胚胎，在一个夜间运行成像。根据所需的实验，可以通过按比例减少成像场的数量来增加时间分辨率（例如，以 5-10 分钟间隔成像）。
有了这个协议，即使是一次通宵运行也能生成大量数据（分布在 50 个领域的 80-100 个胚胎），而大型实验在数据分析方面可能很快变得难以管理。为了便于处理、可视化和简化此数据的分析，构建了一个程序来裁剪和定向胚胎并执行预处理步骤（可选），以及一个用于编译数据以简化查看的 ImageJ 宏。这些程序可用于处理使用传统方法收集的图像，因为它们独立于成像方法，只需要单个亮场平面。第一个程序采用包含多个胚胎（GUI 选项或源代码embryoCrop.py）的 4D 场，或包含多个胚胎（screenCrop.py）的多个 4D 场，紧密裁剪胚胎，并在前后配置中定向它们。这些程序还为用户提供了执行背景减法、漂移校正和衰减校正的选项。生成的文件是统一的预处理，严格裁剪每个胚胎的tiff堆栈，可以修改为自动图像分析。为了简化查看每种条件的所有胚胎，编写了 ImageJ 宏（OpenandCombine_embsV2.ijm），该宏将给定条件中的所有胚胎组装到单个 tiff 堆栈中，并阵列显示景场图像和最大强度投影颜色（RGB）覆盖，并排，每个胚胎。在一对定制菌株中敲除40个先前描述的发育基因后，通过它们来描述胚胎发育的特征，这些基因得到了验证，这些基因表达荧光标记，这些标记经过优化，以可视化细菌层的关键方面规格和形态生成10，11。半高通量胚胎成像协议和图像处理工具共同作用于实现更高的样本数实验和旨在了解发育过程的大规模筛选工作。此外，这些菌株还将为检查分子扰动对胚胎生成的影响提供一种有效的方法。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

在胚胎发育过程中，胚胎学是系统分析细胞命运规范和形态遗传事件的首要系统。一个挑战是胚胎生成在大约13小时的时间内动态展开;这个半天的时间尺度限制了可以成像的胚胎数量，限制了实验的范围。在这里，我们描述了一个半高通量协议，它允许在一次夜间运行中，以中等时间分辨率、从多达 14 个不同条件对 80-100 个胚胎进行同步 3D 延时成像。该协议非常简单，任何实验室都可以通过具有点访问能力的显微镜进行实施。该协议的效用通过用它来成像两个定制的菌株来演示荧光标记，这些荧光标记经过优化，以可视化细菌层规范和形态生成的关键方面。为了分析数据，构建了一个自定义程序，该程序在所有通道、z 步长和时间点中从更广泛的视野中裁剪单个胚胎，并将每个胚胎的序列保存到单独的 tiff 堆栈中。该程序包括用户友好的图形用户界面 （GUI），通过隔离、预处理和统一定向单个胚胎来简化数据处理，为可视化或自动分析做好准备。还提供了一个 ImageJ 宏，该宏将单个胚胎数据编译为多面板文件，在每个时间点显示每个胚胎的最大强度荧光投影和亮场图像。本文描述的协议和工具通过使用它们来描述胚胎发育的特征，在击倒40个先前描述的发育基因之后;此分析可视化了以前用的分着的发育表型，并揭示了新的表型。总之，这项工作详细介绍了半高通量成像方法，以及裁剪程序和 ImageJ 可视化工具，当与表达信息荧光标记的菌株结合使用时，可以大大加快分析实验胚胎发育。

在描述分子扰动对C.elegans胚胎发育的影响时，一个重大挑战是，胚胎从第一次裂解到20°16的伸长结束大约需要10小时。一种半高通量方法，其中可以同时成像大量胚胎，这种方法对于此时间尺度的事件非常有用，因为它允许同时对多个条件进行成像，并为每个条件提供足够的组合大小，从而实现定量分析 （图 1A.
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A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

这项工作描述了一个半高通量协议，允许在一次一夜的运行中同时对80-100 C.elegans胚胎的胚胎发生进行3D延时成像。此外，还包括图像处理和可视化工具，以简化数据分析。这些方法与自定义报告菌株相结合，有助于详细监测胚胎生成。

半高通量成像方法和数据可视化工具包，用于分析C. elegans胚胎发育

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

C.elegans 胚胎形成大约需要 13 小时，通常通过一次拍摄一个胚胎来监测。然而，我们的协议允许同时对80到100个胚胎进行3D时间推移成像。为大量发育中的C.elegans胚胎收集数据的能力开辟了一系列新的实验，包括发育事件的定量分析和大规模筛选。该协议可以很容易地适应捕捉不同的发育过程或图像胚胎表达任何组合的标记在感兴趣的组织。将胚胎适当分散在井中是很有挑战性的。它们应该紧密地结合在一起，以便捕获每个场的多个胚胎，而不会聚集在不同的Z平面上。我们建议使用两个研究人员进行并排解剖，在冰上，并堵住未使用的油井。我们还将演示一些有用的技巧，以快速设置一个良好的舞台384井板。首先用PCR粘合箔密封一个玻璃底384孔板，以掩盖未使用的油井。使用剃须刀或手术刀切割铝箔，以暴露用于的井的子集。在每个井中加入70微升新鲜准备的TMHC，并将盘子放在冰上。排除板的外两行，以防止边缘效应。为了快速制备样品，建议两位研究人员进行并排解剖。当所有溶液都镀上时，使用精细的钳子和解剖显微镜将大约 10 名重力成人转移到 150 微升的冰冷 TMHC 溶液中，每个情况只有一个凹陷幻灯片。使用钳子和手术刀，解剖蠕虫释放胚胎，并加载一个拉毛细管移液器到口腔吸气器。使用口移液器将所有两到八个细胞阶段的胚胎转移到准备好的板的单个孔中，并检查该板以确认任何孔中不存在任何聚集体。收集所有胚胎后，通过离心沉淀标本，并使用乙醇浸泡的湿巾清除板底的任何残留物。将板放在装有温度控制环境的共体显微镜的板架中，并使用 10 倍目标对每一个井进行预扫描，以识别具有合适胚胎的田地。扫描结束时，切换到 60X 目标，调整每个点的焦点平面，以每井成像 1 到 4 个场，每 20 分钟以 2 微米间隔获取 18 个 Z 节，间隔 10 小时。获得所有图像后，执行低、全井光场扫描，大约在开始夜间成像后 20 到 24 小时，以评估胚胎的致命性。对于使用胚胎CropUI可执行文件自动裁剪，首先从Zenodo和测试文件下载程序。zip 以确定程序是否在平台上正常工作。一旦下载，解压缩和导航找到胚胎CropUI可执行文件，并双击启动程序。选择"打开"可加载第一个特定的 4D 视图字段以裁剪。裁剪具有多个尺寸的 TIFF 系列时，仅加载文件夹中序列中的第一个图像。加载所有图像后，请指定成像参数，选择背景减法和衰减校正，并设置图像收集顺序和每像素微米。然后选择"运行"，将在与未裁剪文件夹相同的路径中创建标记裁剪的新子文件夹，裁剪的版本将保存在此位置。对于可视化，下载打开和组合的 MSV2 ImageJ 插件和图形用户界面说明 Zenodorepov2。docx 从 Zenodo 和打开插件在 Imagej 。找到第三行和第四行，并输入裁剪后存储图像文件夹的位置。要处理的条件的图像文件夹名称，以及每个通宵实验的唯一字母数字标识符。输入所有信息后，单击"运行"。将出现一个窗口，该窗口将启动一个提示，以导航到包含裁剪的图像文件夹的外部文件夹。一旦选定，将出现另一个窗口，这将允许规格的成像参数。单击"确定"。复合文件将开始组装。生成复合后，查看保持打开状态的文件。结合自定义报告器应变进行成像时，可为大多数重大发展事件提供信息的读数。包括硫酸盐规格、对板间分质、表皮外壳、伸长和神经生成。注射后 24 小时是成像的最佳时间点。到此，母体蛋白的耗竭和酶基因表达的抑制都是有效产生不同，高可重复的特征表型跨越涉及硫酸盐规范和形态生成的广泛基因谱。在解剖和胚胎选择步骤中保持耐心是重要的。最大限度地减少包装和选择适当的焦点平面对于确保高质量数据也至关重要。我们的协议可以与各种荧光标记菌株一起执行，并结合RNAi或突变体。我们的处理工具允许简化、自动化或手动数据分析。利用此处描述的菌株、方法和工具，我们的团队对胚胎发育所需的大约 2，000 个基因进行了基于 RNAi 的高含量屏幕。半高吞吐量方法对该项目至关重要。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

通过在胚胎梅克尔软骨Zebrabow克隆细胞分析软骨插层和定向扩散的可视化

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

科研

发育生物学

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

转录组分析]<em&gt;活体</em&gt;生产牛胚胎植入前胚胎采用双色微阵列平台

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

斑马鱼发展长期成像的多功能安装方法

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

通过高通量抑制剂筛选鉴定调节胚胎干细胞多能性的激酶的简单方法

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

胚胎血管生成的可视化和定量分析<em&gt;热带非洲爪蟾</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

多光子时间推移成像实时可视化发展： 迁移神经嵴细胞在斑马鱼胚胎中的可视化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

固定化的线虫线虫分析神经元内细胞的转运

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

脊髓培养法研究胚胎鸡组织的发展

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

秀丽线虫生殖的计算分析研究细胞核、蛋白质和细胞骨架的分布

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

亚细胞分辨率的各向同性光片显微镜及细胞自动动力学分析

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...