Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O. blev støttet af National Institute of General Medical Sciences-sponsoreret University of California San Diego institutionel forskning og akademisk karriereudvikling Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). E.kr. og K.O. blev støttet af Ludwig Institute for Cancer Research, som også gav dem forskningsmidler, der blev brugt til at støtte dette arbejde. Vi er taknemmelig for Andrew Chisholm for hans råd i de tidlige faser af dette projekt, Ronald Biggs for bidrag til dette projekt efter den indledende metode udviklingsfasen, og Dave Jenkins og Andy Shiau for støtte og adgang til den lille molekyle opdagelse koncernens High-Content Imaging System.

1. klargøring af C. elegans -embryoner til billedbehandling med halv højt gennemløb
Bemærk: Målet med denne del af protokollen er at indlæse en population af semi-synkroniseret (2 til 8-celle fase) C. elegans embryoner, dissekeret fra egnede markør stammer (figur 2), i en glas-bund 384-brønd plade til billeddannelse. Andre plade formater kan også fungere, men 384 brønd pladerne foretrækkes, fordi den lille brønd større...

<ol>
	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

Dette arbejde beskriver en række værktøjer og metoder, der blev udviklet for at muliggøre større indsats for at profilere funktionen af gener i embryonale udvikling i C. elegans. Vores semi-High-gennemløb metode tillader 3D time-lapse billeddannelse af embryonale udvikling ved 20 min opløsning for 80 – 100 embryoner i et enkelt eksperiment. Mens denne protokol kan tilpasses til brug med enhver ønsket markør stamme (r), dette arbejde demonstrerer potentialet i metoden ved hjælp af to brugerdefinerede ...

C. elegans embryo er et vigtigt model system for mekanistisk cellebiologi og analyse af celle skæbne specifikation og morfogenetiske hændelser kørsel embryonale udvikling1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Til dato, meget af karakteriseringen af både cellulære-niveau begivenheder og celle skæbne specifikation i embryonet er opnået ved hjælp af relativt høj tidsmæssig opløsning en-til-en-tid billeddannelse eksperimenter (dvs. erhvervelse hver 10 – 100 s) af embryoner, der udtrykker fluorescerende markører. Selv om det er velegnet til begivenheder på rækkefølgen af sekunder til snesevis af minutter, denne fremgangsmåde bliver teknisk begrænsende for karakterisering af længere processer, på rækkefølgen af timer til dage. Embryonale udvikling fra første spaltning til slutningen af forlængelse tager omkring 10 h. På denne tid-skala, semi-High-gennemløb metoder, der ville give mulighed for samtidige lavere tidsopløsning billeddannelse (dvs. erhvervelse på 5 – 20 minutters tidsintervaller) af større kohorter af embryoner, fra forskellige betingelser, ville åbne op for en ny række eksperimenter; f. eks. muliggøre systematiske, omfattende Screenings bestræbelser og analyse af et tilstrækkeligt antal embryoner til sammenligning af følgerne af molekylære forstyrrelser.
Her beskriver vi en semi-High-gennemløb metode til overvågning C. elegans embryo Genesis, der muliggør samtidig 3D time-lapse billeddannelse af udvikling i 80 – 100 embryoner, fra op til 14 forskellige betingelser, i en enkelt overnight køre. Protokollen er ligetil at gennemføre og kan udføres af ethvert laboratorium med adgang til et mikroskop med punkt besøgs muligheder. De vigtigste trin i denne protokol er skitseret i figur 1. Kort sagt dissekeret embryoner fra gravid voksne, der udtrykker fluorescerende markører af interesse og overfører unge embryoner (2 – 8 celle trin) til brønde af en 384-brønd plade til billeddannelse. I dette format tragter den relativt lille brønd størrelse embryoner ind i et snævert område, hvilket letter identifikationen af felter, der indeholder flere embryoner til tidsforskudt billeddannelse. For at opretholde nogenlunde synkrone udvikling på tværs af kohorten af embryoner udføres dissektioner i kølede medier, og pladen holdes på is, hvilket forhindrer en betydelig udvikling i det time lange dissektions tidsvindue. Pladen overføres til mikroskopet, og embryonerne optages i et temperaturkontrolleret rum om natten, med 20 minutters tidsintervaller, ved hjælp af en 60x olie fordybning 1,35 NA linse, for at indsamle hele z-området i 2 μm trin. 50 felter, der hver indeholder mellem 1 – 5 embryoner, er inddelt i en enkelt overnight kørsel. Afhængigt af det ønskede eksperiment kan tids opløsningen forøges (f. eks. med 5 – 10 minutters intervaller) ved proportionalt at formindske antallet af felter med afbildet.
Med denne protokol genererer selv en enkelt overnight kørsel en betydelig mængde data (80 – 100 embryoner spredt ud over 50 felter), og større eksperimenter kan hurtigt blive uoverskuelige med hensyn til dataanalyse. For at lette behandling, visualisering og strømlinet analyse af disse data blev et program bygget til at beskære og orientere embryoner og udføre forbehandlings trin (valgfrit) og en ImageJ makro, der samler dataene for at forenkle visningen. Disse programmer kan bruges til at behandle billeder indsamlet ved hjælp af konventionelle tilgange, da de er uafhængige af billedbehandlings metoden, der kun kræver et enkelt lysfelt-fly. Det første program tager i et 4d felt, der indeholder flere embryoner (GUI option eller kildekode embryoCrop.py) eller flere 4d felter, der indeholder flere embryoner (screenCrop.py), stramt afgrøder embryoner og orienterer dem i en anterior-posterior konfiguration. Disse programmer giver også brugerne mulighed for at udføre baggrunds subtraktion, drift korrektion og dæmpning korrektion. De resulterende filer er ensartet forbehandlet, stramt beskåret TIFF stakke for hvert embryo, der kan ændres til automatiseret billedanalyse. For at gøre det enklere at se alle embryoner for hver betingelse, en ImageJ makro (OpenandCombine_embsV2. IJM) blev skrevet, som samler alle embryoner fra en given betingelse i en enkelt TIFF stack og arrays lysfelt billeder og maksimal intensitet projektion farve ( RGB) overlejringer, side om side, for hvert embryo. Metoderne blev valideret ved at bruge dem til at karakterisere embryonale udvikling efter knock-down af 40 tidligere beskrevne udviklingsmæssige gener i et par specialbyggede stammer, der udtrykker fluorescerende markører optimeret til at visualisere centrale aspekter af kimlag specifikation og morfogenesis10,11. Sammen, den semi-høj gennemløb embryo Imaging protokol og billedbehandling værktøjer vil muliggøre højere prøve antal eksperimenter og storstilet screening indsats med henblik på at forstå udviklingsmæssige processer. Desuden vil disse stammer også give et effektivt middel til at undersøge virkningerne af molekylære forstyrrelser på embryogenese.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

C. elegans er det førende system til systematisk analyse af celle skæbne specifikation og morfogenetiske hændelser under fosterudvikling. En udfordring er, at embryogenese dynamisk udfolder sig over en periode på omkring 13 h; denne halve dag lange tidshorisont har begrænset omfanget af eksperimenter ved at begrænse antallet af embryoner, der kan imaged. Her beskriver vi en protokol med halv højt gennemløb, der muliggør samtidig 3D-tidsforskudt billeddannelse af udvikling i 80 – 100 embryoner ved moderat tidsopløsning, fra op til 14 forskellige forhold, i en enkelt overnight kørsel. Protokollen er ligetil og kan gennemføres af ethvert laboratorium med adgang til et mikroskop med punkt besøgs kapacitet. Nytten af denne protokol er demonstreret ved at bruge den til at billedet to specialbyggede stammer udtrykker fluorescerende markører optimeret til at visualisere centrale aspekter af kimlag specifikation og morphogenesis. For at analysere data, et brugerdefineret program, der beskærer individuelle embryoner ud af et bredere synsfelt i alle kanaler, z-trin og tidspunkter og gemmer sekvenser for hvert embryo i en separat TIFF stak blev bygget. Programmet, som omfatter en brugervenlig grafisk brugergrænseflade (GUI), strømliner databehandling ved isolering, forbehandling, og ensartet orientere individuelle embryoner som forberedelse til visualisering eller automatiseret analyse. Leveres også er en ImageJ makro, der samler individuelle embryo data i en multi-panel fil, der viser maksimal intensitet fluorescens projektion og lysfelt billeder for hvert embryo på hvert tidspunkt. De protokoller og værktøjer, der er beskrevet heri, blev valideret ved at bruge dem til at karakterisere embryonale udvikling efter knock-down af 40 tidligere beskrevne udviklingsmæssige gener; denne analyse visualiserede tidligere annoterede udviklingsmæssige fænotyper og afslørede nye. Sammenfattende, dette arbejde detaljer en semi-High-gennemløb Imaging metode kombineret med en beskæring program og ImageJ visualisering værktøj, der, når det kombineres med stammer udtrykker informative fluorescerende markører, i høj grad accelererer eksperimenter til at analysere embryonale udvikling.

En betydelig udfordring i at karakterisere virkningen af molekylære forstyrrelser på C. elegans embryonale udvikling er, at det tager omkring 10 h for embryoner til at gøre fremskridt fra første kavalergang til slutningen af forlængelse ved 20 °16. En metode med halv høj gennemløb, hvor store kohorter af embryoner kan afbildes samtidigt, er nyttig for begivenheder på denne tidsskala, fordi den muliggør billeddannelse af flere forhold parallelt med en tilstrækkelig ensemble stø...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Dette arbejde beskriver en semi-High-gennemløb protokol, der tillader samtidige 3D time-lapse Imaging af embryogenese i 80 – 100 C. elegans embryoner i en enkelt overnight kørsel. Derudover er billedbehandling og visualiseringsværktøjer inkluderet for at strømline dataanalyse. Kombinationen af disse metoder med brugerdefinerede reporter stammer muliggør detaljeret monitorering af embryogenese.

Et semi-High-gennemløb Imaging metode og data visualisering Toolkit til at analysere C. elegans embryonale udvikling

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

C.elegans embryogenese tager omkring 13 timer, og er normalt overvåges ved at filme et foster ad gangen. Vores protokol tillader dog samtidig 3D-tidsforfald af 80 til 100 embryoner. Evnen til at indsamle data for et stort antal udviklende C.elegans embryoner åbner op for en ny række eksperimenter, herunder kvantitativ analyse af udviklingshændelser og store skærme.Denne protokol kan let tilpasses til at fange forskellige udviklingsprocesser eller til billedembryoner, der udtrykker enhver kombination af markører i væv af interesse. Det er udfordrende at sprede embryonerne i brøndene ordentligt. De bør være tæt på hinanden for at muliggøre opsamling af flere embryoner pr. mark uden at klumpe sig sammen i forskellige Z-fly.Vi anbefaler at bruge to forskere til side-by side dissektion, på is, og blokere ubrugte brønde. Vi vil også demonstrere nogle nyttige tricks til hurtigt at oprette en velafdelt 384-brønd plade. Begynd med at forsegle en glasbundet 384-brøndplade med PCR-klæbefolie til at maskere ubrugte brønde.Brug en barbermaskine eller skalpel til at skære væk folien til at udsætte en delmængde af brøndene til brug. Tilsæt 70 mikroliter frisklavet TMHC i hver brønd og hold pladen på is. Udeluk de ydre to rækker af pladen for at forhindre kanteffekter.For hurtig prøve forberedelse, side-by-side dissektion af to forskere anbefales. Når hele opløsningen er blevet belagt, skal du bruge fine pincet og et dissektionsmikroskop til at overføre ca. 10 gravide voksne til 150 mikroliter iskold TMHC-opløsning inden for et depressionsslid pr. tilstand. Brug pincet og en skalpel, dissekere ormene til at frigive embryoner og indlæse en trukket kapillær pipette i en mund aspirator.Brug mundpipetten til at overføre alle de to til otte-cellede fase embryoner i individuelle brønde af den forberedte plade og undersøge pladen for at bekræfte, at ingen aggregater er til stede i nogen brønde. Når alle embryonerne er indsamlet, skal prøverne lægges på ved centrifugering, og der anvendes en ethanolslet tør for at fjerne eventuelle rester fra pladens bund. Pladen i pladeholderen på et konfokalt mikroskop, der er udstyret med et temperaturstyret miljø, og brug 10X-målet til at udføre en forskanning af hver brønd for at identificere felter med egnede embryoner.Ved scanningens afslutning skiftes til 60X-målet, omdrejningspunktet på hvert punkt justeres til billede et til fire felter pr. brønd og erhverves 18 Z-sektioner med to mikrometerintervaller hvert 20. Når alle billederne er erhvervet, udføre en lav, hele godt brightfield scanning, ca 20 til 24 timer efter starten af natten billeddannelse til at vurdere embryonale dødelighed. For automatiseret beskæring ved hjælp af embryoCropUI eksekverbare, først downloade programmet fra Zenodo og testfiler.for at afgøre, om programmet fungerer korrekt på platformen. Når downloadet, lyne og navigere for at finde embryoCropUI eksekverbare fil og dobbeltklik for at starte programmet. Vælg åben for at indlæse det første specifikke 4D-synsfelt, der skal beskæres.Når du beskærer en TIFF-serie med flere dimensioner, indlæses kun det første billede i serien i mappen. Når alle billederne er indlæst, angives billedparametrene, skal du vælge korrektion af baggrundsindtrækkelse og dæmpning og indstille billedsamlingsrækkefølgen og mikron pr. pixel. Vælg derefter Kør, en ny undermappe med etikette dyrkning oprettes på samme sti som den ikke-trængte mappe, og de beskårne versioner gemmes på denne placering.For visualisering, downloade den åbne og kombinerede MSV2 ImageJ plugin og grafiske brugergrænseflade instruktioner Zenodorepov2. docx fra Zenodo og åbne plugin i IMageJ. Find linje tre og fire, og indtast den placering, hvor billedmapperne gemmes efter beskæringen.Billedmappenavnene på de betingelser, der skal behandles, og det entydige alfanumeriske id for hvert eksperiment for natten. Når alle oplysningerne er angivet, skal du klikke på Kør. Der vises et vindue, hvor der vises en meddelelse om at navigere til den ydre mappe, der indeholder de beskårne billedmapper.Når du har valgt et andet vindue vises, som vil give mulighed for specifikation af billeddannelse parametre. Klik okay. Den sammensatte fil begynder at samle.Når den sammensatte er blevet genereret, skal du gennemse de filer, der står åbne. Når afbildet i forbindelse brugerdefinerede reporter stammer giver informative udlæsninger for de fleste større udviklingsmæssige begivenheder. Herunder sulfat specifikation, dorsal intercalation, epidermal kabinet, forlængelse, og neurogenese.24 timer efter injektion er et optimalt tidspunkt for billeddannelse. Fra dette tidspunkt er maternel proteinudtynding og hæmning af zygotisk genekspression både effektivt, hvilket giver forskellige, meget reproducerbare signaturfænotyper på tværs af et bredt spektrum af gener, der er involveret i sulfatspecifikation og morfogenese. Det er vigtigt at være tålmodig under dissektions- og embryoudvælgelsestrinne.Minimering af sammenklumpning og valg af passende fokalplaner er også afgørende for at sikre data af høj kvalitet. Vores protokol kan udføres med en række fluorescerende markørstammer og i kombination med RNAi eller mutanter. Vores behandlingsværktøjer giver mulighed for strømlinet, automatiseret eller manuel dataanalyse.Ved hjælp af stammer, metoder og værktøjer, der er beskrevet her vores gruppe udført en RNAi-baseret højt indhold skærm rettet mod ca 2,000 gener, der kræves for embryonale udvikling. Semi-høj gennemløb metoder var afgørende for dette projekt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering af Chondrocyt Intercalation og Directional spredning via Zebrabow Klonal Cell Analysis i Embryonale Meckel s Brusk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering<em&gt; In-vivo</em&gt; Produceret Bovine præimplantationsembryoner Brug To farve Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Et alsidigt Montering Metode til Long Term Imaging af zebrafisk Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En simpel metode til at identificere kinaser, der regulerer embryonisk stamcellepluripotens ved høj gennemstrømningshæmmende screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse af embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi Photon tid bortfalder Imaging til at visualisere udvikling i realtid: visualisering af overflytning neurale Crest celler i zebrafisk embryoner

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering af Caenorhabditis elegans at analysere intracellulær Transport i neuroner

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk lys-Sheet mikroskopi og automatiseret celle Lineage analyser til kataloget Caenorhabditis elegans Embryogenesis med Subcellular opløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...