Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O. werd gesteund door het National Institute of General Medical Sciences-gesponsord University of California San Diego Institutional Research en Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. en K.O. werden gesteund door het Ludwig Institute for Cancer Research, dat hen ook onderzoeksmiddelen verschafte om dit werk te ondersteunen. We zijn Andrew Chisholm dankbaar voor zijn advies in de vroege fases van dit project, Ronald Biggs voor bijdragen aan dit project na de initiële methode ontwikkelingsfase, en Dave Jenkins en Andy Shiau voor ondersteuning en toegang tot de Small molecule Discovery beeld systeem met hoge inhoud van de groep.

1. voorbereiding van C. elegans embryo's voorbeeld vorming met semi-hoge doorvoer
Opmerking: Het doel van dit deel van het protocol is het laden van een populatie van semi-gesynchroniseerde (2 tot 8-cel stage) C. elegans embryo's, ontleed uit geschikte marker stammen (Figuur 2), in een glazen bodem 384-well plate voor Imaging. Andere plaat formaten kunnen ook werken, maar de 384 well Plates hebben de voorkeur omdat de kleine put de...

<ol>
	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

Dit werk beschrijft een reeks instrumenten en methoden die zijn ontwikkeld om grotere inspanningen mogelijk te maken om de functie van genen in embryonale ontwikkeling in C. eleganste profile eren. Onze semi-High-throughput methode maakt het mogelijk om 3D-timelapse-beeldvorming van embryonale ontwikkeling met 20 minuten resolutie voor 80 – 100 embryo's in één experiment. Hoewel dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met elke gewenste marker stam (en), demonstreert dit werk het potentieel van de meth...

De C. elegans embryo is een belangrijk modelsysteem voor mechanistische celbiologie en analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen die embryonale ontwikkeling stimuleren1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Tot op heden is veel van de karakterisering van zowel gebeurtenissen op cellulair niveau als de specificatie van het lot van cellen in het embryo bereikt met behulp van relatief hoge temporele resolutie One-at-a-time Imaging experimenten (d.w.z. acquisitie elke 10 – 100 s) van embryo's die fluorescerende markers. Hoewel zeer geschikt voor gebeurtenissen op de orde van seconden tot tientallen minuten, wordt deze aanpak technisch beperkt voor de karakterisering van langere processen, op de volgorde van uren tot dagen. Embryonale ontwikkeling van het eerste decolleté tot het einde van de rek duurt ongeveer 10 uur. Op deze tijdschaal, semi-hoge doorvoer methoden die ervoor zorgen dat gelijktijdige lagere tijdresolutie Imaging (d.w.z. acquisitie met 5 – 20 min tijdsintervallen) van grotere cohorten van embryo's, van verschillende omstandigheden, zou een nieuwe reeks experimenten openen; bijvoorbeeld het mogelijk maken van systematische grootschalige screening-inspanningen en de analyse van voldoende aantallen embryo's voor vergelijkingen van de gevolgen van moleculaire verstoringen.
Hier beschrijven we een semi-High-throughput-methode voor het bewaken van C. elegans embryogenese die gelijktijdige 3D-timelapse-beeldvorming van de ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo's, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig te implementeren en kan worden uitgevoerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek mogelijkheden. De belangrijkste stappen in dit protocol zijn uiteengezet in Figuur 1. In het kort, embryo's worden ontleed van zwangere volwassenen uitdrukken van fluorescerende markers van belang en overdracht van jonge embryo's (2 – 8 cel stage) naar putten van een 384-put voorbeeld vorming. In dit formaat, de relatief kleine goed grootte trechters embryo's in een smal gebied, die de identificatie van velden met meerdere embryo's voor time-lapse beeldvorming vergemakkelijkt. Om ruwweg synchrone ontwikkeling in de cohort van embryo's te handhaven, worden dissecties uitgevoerd in gekoelde media en wordt de plaat op ijs gehouden, waardoor significante ontwikkeling tijdens het urenlange dissectie tijdvenster wordt voorkomen. De plaat wordt overgebracht naar de Microscoop en de embryo's worden gefilmd in een kamer met temperatuurregeling, 's nachts, op 20 min tijdsintervallen, met een 60x olie onderdompeling 1,35 NA lens, om het volledige z-bereik in stappen van 2 μm te verzamelen. 50 velden, elk met een tussen 1 – 5 embryo's, worden in één enkele nacht run afgebeeld. Afhankelijk van het gewenste experiment kan de tijdresolutie worden verhoogd (bijvoorbeeld Imaging met intervallen van 5 tot 10 minuten) door het aantal afbeeldingsvelden proportioneel te verlagen.
Met dit protocol genereert zelfs één overnight run een aanzienlijke hoeveelheid gegevens (80 – 100 embryo's verspreid over 50 velden) en grotere experimenten kunnen snel onbeheersbaar worden met betrekking tot data-analyse. Om de verwerking, visualisatie en stroomlijn analyse van deze gegevens te vergemakkelijken, werd een programma gebouwd om embryo's uit te snijden en te oriënteren en pre-processing stappen uit te voeren (optioneel), en een ImageJ-macro die de gegevens compileert om de weergave te vereenvoudigen. Deze Programma's kunnen worden gebruikt om beelden te verwerken die zijn verzameld met conventionele benaderingen, omdat ze onafhankelijk zijn van de beeldvormings methode, waarbij slechts één brightfield-vlak vereist is. Het eerste programma neemt een 4D-veld met meerdere embryo's (GUI-optie of broncode embryoCrop.py) of meerdere 4D-velden met meerdere embryo's (screenCrop.py), snijdt embryo's goed en oriënteert ze in een anterieure-posterieure configuratie. Deze Programma's geven gebruikers ook de mogelijkheid om achtergrond aftrekken, drift correctie en demping correctie uit te voeren. De resulterende bestanden zijn uniform voorbewerkte, strak bijgesneden TIFF-stapels voor elk embryo dat kan worden geamendeerbaar voor geautomatiseerde beeldanalyse. Om het eenvoudiger te maken om alle embryo's voor elke aandoening te bekijken, is een ImageJ-macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) geschreven, die alle embryo's van een bepaalde voorwaarde samenstelt tot één TIFF-stack en matrices van brightfield-afbeeldingen en projectie kleur voor maximale intensiteit ( RGB)-overlays, naast elkaar, voor elk embryo. De methoden werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen in een paar op maat gebouwde stammen die fluorescerende markers uitdrukken die geoptimaliseerd zijn om belangrijke aspecten van kiem-laag te visualiseren specificatie en morfogenese10,11. Samen zullen de semi-hoge doorvoer embryo Imaging protocol en beeldverwerkings hulpmiddelen hogere sample-getalexperimenten en grootschalige screening-inspanningen mogelijk maken die gericht zijn op het begrijpen van ontwikkelingsprocessen. Daarnaast zullen deze stammen ook een efficiënt middel zijn om de effecten van moleculaire verstoringen op embryogenese te onderzoeken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

C. elegans is het belangrijkste systeem voor de systematische analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen tijdens de embryonale ontwikkeling. Een uitdaging is dat embryogenese dynamisch zich ontvouwt over een periode van ongeveer 13 uur; deze tijdschaal van een halve dag heeft de reikwijdte van experimenten beperkt door het aantal embryo's dat kan worden gefotografeerd te beperken. Hier beschrijven we een semi-High-throughput-protocol dat de gelijktijdige 3D-time-lapse-beeldvorming van ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo's bij matige tijdresolutie, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig en kan worden geïmplementeerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek capaciteit. Het nut van dit protocol wordt aangetoond door het te gebruiken om beeld twee op maat gebouwde stammen uitdrukken fluorescerende markers geoptimaliseerd voor het visualiseren van belangrijke aspecten van de kiem-laag specificatie en morfogenese. Om de gegevens te analyseren, is een aangepast programma dat individuele embryo's uit een breder gezichtsveld in alle kanalen, z-stappen en tijdpunten snijdt en de sequenties voor elk embryo opslaat in een aparte TIFF-stapel gebouwd. Het programma, dat een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) bevat, stroomlijnt de gegevensverwerking door afzonderlijke embryo's te isoleren, vooraf te verwerken en uniform te oriënteren in voorbereiding op visualisatie of geautomatiseerde analyse. Ook meegeleverd is een ImageJ-macro die individuele embryo gegevens compileert in een bestand met meerdere panelen dat de maximale intensiteit fluorescentie projectie en brightfield-afbeeldingen voor elk embryo op elk tijdstip weergeeft. De protocollen en hulpmiddelen die hierin worden beschreven, werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen; deze analyse visualiseerde eerder geannoleerde ontwikkelings fenotypes en onthulde nieuwe. Kortom, dit werk Details een semi-hoge doorvoer imaging methode in combinatie met een bijsnijden programma en ImageJ visualisatietool die, in combinatie met stammen uitdrukken informatieve fluorescerende markers, sterk versnelt experimenten te analyseren embryonale ontwikkeling.

Een belangrijke uitdaging bij het karakteriseren van het effect van moleculaire perturbaties op C. elegans embryonale ontwikkeling is dat het ongeveer 10 uur duurt voordat embryo's van het eerste decolleté tot het einde van de rek op 20 °16worden uitgevoerd. Een semi-High-throughput methode waarbij grote cohorten van embryo's tegelijkertijd kunnen worden afgebeeld, is handig voor gebeurtenissen op deze tijdschaal, omdat het beeldvorming van meerdere voorwaarden parallel met een voldoend...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

C.elegans embryogenese duurt ongeveer 13 uur, en wordt meestal gecontroleerd door het filmen van een embryo tegelijk. Ons protocol maakt echter de gelijktijdige 3D time lapse imaging van 80 tot 100 embryo's mogelijk. De mogelijkheid om gegevens te verzamelen voor grote aantallen ontwikkelende C.elegans embryo's opent een nieuwe reeks experimenten, waaronder kwantitatieve analyse van ontwikkelingsgebeurtenissen en grootschalige schermen.Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende ontwikkelingsprocessen vast te leggen of om embryo's die elke combinatie van markers in interessant weefsel uitdrukken, in beeld te brengen. Het is een uitdaging om de embryo's goed te verspreiden in de putten. Ze moeten dicht bij elkaar zijn om het vangen van meerdere embryo's per veld mogelijk te maken zonder samen te klonteren in verschillende Z-vlakken.We raden aan om twee onderzoekers te gebruiken voor naast elkaar dissectie, op ijs, en het blokkeren van ongebruikte putten. We zullen ook een aantal handige trucs demonstreren voor het snel opzetten van een goed geënsceneerde 384-put plaat. Begin met het afdichten van een 384-put plaat met glazen bodem met PCR-kleeffolie om ongebruikte putten te maskeren.Gebruik een scheermes of scalpel om de folie weg te snijden om een deel van de putten voor gebruik bloot te leggen. Voeg 70 microliter vers bereide TMHC in elke put en houd de plaat op ijs. Sluit de buitenste twee rijen van de plaat uit om randeffecten te voorkomen.Voor snelle monstervoorbereiding wordt side-by-side dissectie door twee onderzoekers aanbevolen. Wanneer alle van de oplossing is verguld, gebruik maken van fijne pincet en een dissectie microscoop om ongeveer 10 aangetrokken volwassenen over te dragen in 150 microliters van ijskoude TMHC oplossing binnen een depressie dia per aandoening. Met behulp van de pincet en een scalpel ontleed je de wormen om de embryo's los te laten en een getrokken capillaire pipet in een mondspirator te laden.Gebruik de mondpipet om alle twee tot acht-cel fase embryo's over te brengen in individuele putten van de voorbereide plaat en de plaat te onderzoeken om te bevestigen dat er geen aggregaten aanwezig zijn in de putten. Wanneer alle embryo's zijn verzameld, regelen de monsters door centrifugatie en gebruik een ethanol gedrenkt doek om eventuele residu te verwijderen uit de bodem van de plaat. Plaats de plaat in de plaathouder van een confocale microscoop uitgerust met een temperatuurgestuurde omgeving en gebruik de 10X doelstelling om een pre-scan van elke put uit te voeren om velden met geschikte embryo's te identificeren.Schakel aan het einde van de scan over naar de 60X-doelstelling, pas het brandpuntsvlak op elk punt aan op één tot vier velden per put en verwerf 18 Z-secties met twee micrometerintervallen per 20 minuten gedurende 10 uur. Wanneer alle beelden zijn verworven, voert u een lage, hele goed brightfield-scan uit, ongeveer 20 tot 24 uur na het begin van de nachtbeeldvorming om de embryonale letaliteit te beoordelen. Voor geautomatiseerd bijsnijden met embryoCropUI uitvoerbaar, download eerst het programma van Zenodo en de testfiles.zip om te bepalen of het programma goed functioneert op het platform. Eenmaal gedownload, unzip en navigeren om de embryoCropUI uitvoerbare bestand te vinden en dubbelklik om het programma te starten. Selecteer open om het eerste specifieke gezichtsveld 4D te laden om bij te snijden.Wanneer u een TIFF-serie met meerdere dimensies bijsnijdt, wordt alleen de eerste afbeelding in de reeks in de map geladen. Wanneer alle afbeeldingen zijn geladen, geeft u de beeldvormingsparameters op, selecteert u achtergrondaftrekkende en dempingscorrectie en stelt u de volgorde van de afbeeldingsverzameling en de micron per pixel in. Selecteer vervolgens uitvoeren, wordt een nieuwe submap met het label bijsnijden gemaakt in hetzelfde pad als de niet-bijgesneden map en worden de bijgesneden versies op deze locatie opgeslagen.Voor visualisatie u de open en gecombineerde MSV2 ImageJ-plug-in en grafische gebruikersinterface-instructies Zenodorepov2 downloaden. docx van Zenodo en open de plugin in IMageJ. Zoek lijnen drie en vier en voer de locatie in waar de afbeeldingsmappen na het bijsnijden worden opgeslagen.De namen van de afbeeldingsmap van de te verwerken voorwaarden en de unieke alfanumerieke id voor elk experiment 's nachts. Wanneer alle gegevens zijn ingevoerd, klikt u op Uitvoeren. Er verschijnt een venster waarmee een prompt wordt gestart om naar de buitenste map te navigeren met de bijgesneden afbeeldingsmappen.Eenmaal geselecteerd verschijnt er een ander venster dat de beeldparameters kan specificatie mogelijk maken. Klik goed. Het samengestelde bestand zal beginnen te monteren.Wanneer de compositie is gegenereerd, controleert u de bestanden die zijn geopend. Wanneer afgebeeld in combinatie aangepaste reporter stammen bieden informatieve uitlezingen voor de meeste grote ontwikkelingsgebeurtenissen. Inclusief sulfaatspecificatie, dorsale intercalatie, epidermale behuizing, rek en neurogenese.24 uur na injectie is een optimaal tijdspunt voor beeldvorming. Vanaf dit moment zijn de uitputting van het moedereiwit en de remming van zygotische genexpressie beide effectief die verschillende, zeer reproduceerbare handtekeningfenotypen opleveren over een breed spectrum van genen die betrokken zijn bij sulfaatspecificatie en morfogenese. Het is belangrijk om geduldig te zijn tijdens de dissectie en embryo selectie stappen.Het minimaliseren van de klonterende en het selecteren van de juiste brandpuntsvlakken zijn ook essentieel voor het waarborgen van gegevens van hoge kwaliteit. Ons protocol kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid aan fluorescerende marker stammen en in combinatie met RNAi of mutanten. Onze verwerkingstools zorgen voor gestroomlijnde, geautomatiseerde of handmatige gegevensanalyse.Met behulp van de stammen, methoden en tools beschreven hier onze groep voerde een RNAi-gebaseerde hoge inhoud scherm gericht op ongeveer 2.000 genen die nodig zijn voor embryonale ontwikkeling. Semi-hoge doorvoermethoden waren essentieel voor dit project.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisatie van Chondrocyte Intercalatie en Directional Proliferatie via Zebrabow Klonale Cell Analysis in het Embryonale Meckel&#39;s Kraakbeen

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profilering van<em&gt; In-Vivo</em&gt; Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo&#39;s met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Een eenvoudige methode om Kinases te identificeren die de embryonale stamcelpluripotency reguleren door middel van high-throughput inhibitor screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...