Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O. היה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית בחסות אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו המחקר המוסדי ופיתוח הקריירה האקדמית פרס (NIH/IRACDA K12 GM068524). Ad ו K.O. תמכו על ידי המכון לודוויג לחקר הסרטן, אשר גם סיפק להם מימון מחקר המשמש לתמיכה זו עבודה. אנו אסירי תודה לאנדרו צ'ישולם על עצתו בשלבים המוקדמים של הפרויקט הזה, רונלד ביגס לתרומות לפרויקט זה לאחר שלב פיתוח השיטה הראשונית, ודייב ג'נקינס ואנדי Shiau לתמיכה וגישה לגילוי המולקולה הקטנה מערכת הדמיה של התוכן הגבוה של הקבוצה.

1 . הכנת העוברים עבור הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה
הערה: המטרה של חלק זה של הפרוטוקול היא לטעון אוכלוסיה של מסונכרן למחצה (2 עד 8-תא הבמה) C. אלגיה עוברים, גזור זני סמן מתאים (איור 2), לתוך התחתון זכוכית 384-צלחת להדמיה. תבניות אחרות צלחת גם לעבוד, אבל 3...

<ol>
	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

עבודה זו מתארת חבילה של כלים ושיטות שפותחו כדי לאפשר מאמצים גדולים יותר לפרופיל הפונקציה של גנים בהתפתחות עובריים בג. שיטת התפוקה הגבוהה שלנו למחצה מאפשרת הדמיה של זמן תלת-ממד של התפתחות עובריים ברזולוציה של 20 דקות עבור 80 – 100 עוברים בניסוי אחד. בעוד פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימו...

העובר C. אלגיה היא מערכת חשובה מודל עבור ביולוגיה של התא מכניסטי וניתוח של מפרט הגורל תא ואירועים גנטיים מורפוליום נהיגה פיתוח עובריים1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. עד היום, רוב האפיון של האירועים ברמה התאית ואת מפרט הגורל התא בעובר הושג באמצעות ברזולוציה גבוהה יחסית הזמן ניסויים הדמיה (כלומר, רכישה כל 10-100 s) של עוברים ביטוי סמני פלורסנט. למרות שמתאים מאוד לאירועים בסדר שניות עד עשרות דקות, גישה זו הופכת להיות מגבילה מבחינה טכנית לאפיון תהליכים ארוכים יותר, בסדר שעות עד ימים. פיתוח עובריים מפני המחשוף הראשון עד סוף התארכות לוקח בערך 10 h. במהלך הזמן הזה, חצי-high-תפוקה שיטות שיאפשרו הדמיה בזמן הנמוך ביותר ברזולוציה נמוכה (כלומר, רכישה ב 5 – 20 מרווחי זמן) של כתרים גדולים יותר של עוברים, מתנאים שונים, יפתח מגוון חדש של ניסויים; לדוגמה, הפעלת מאמצי הקרנה בקנה מידה גדול וניתוח מספר מספיק של עוברים להשוואות של השלכות הרטבאליות המולקולריות.
כאן, אנו מתארים שיטה למחצה התפוקה לניטור C. אלגיה embryogenesis המאפשרת הדמיה בו בזמן תלת-ממד של התפתחות ב 80-100 עוברים, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת לילה. הפרוטוקול הוא פשוט ליישם והוא יכול להתבצע על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם יכולות ביקור הנקודה. השלבים העיקריים בפרוטוקול זה מתוארים באיור 1. בקצרה, עוברים גזור מבוגרים gravid המבטא סמנים פלורסנט של עניין והעברת עוברי צעירים (2 – 8 הבמה התא) כדי בארות של 384-צלחת לוח עבור הדמיה. בתבנית זו, בגודל הטוב יחסית funnels עוברים לתוך אזור צר, אשר מקלה על זיהוי של שדות המכילים עוברים מרובים עבור הדמיה בזמן מפקיעה. כדי לשמור על התפתחות סינכרונית באופן כלשהו על פני הקבוצה של העוברים, הניתוח מבוצע בתקשורת מקורר והצלחת מוחזקת על הקרח, אשר מונע התפתחות משמעותית במהלך שעת הניתוח במשך שעה. הצלחת מועברת המיקרוסקופ והעוברים מצולמים בחדר מבוקר טמפרטורה, ב 20 דקות מרווחי זמן, באמצעות שמן 60x טבילה 1.35 NA עדשה, כדי לאסוף את המלא z-טווח ב 2 יקרומטר שלבים. 50 שדות, כל אחד המכיל בין 1-5 עוברים, הם התמונה במהלך אחד לילה הפעלה. בהתאם לניסוי הרצוי, ניתן להגדיל את רזולוציית הזמן (לדוגמה, הדמיה ב-5-10 דקות) על-ידי הפחתת המספר של שדות הדמיה באופן פרופורציונלי.
עם פרוטוקול זה, אפילו הפעלת לילה אחת מייצרת כמות משמעותית של נתונים (80-100 עוברים הפרושים מעל 50 שדות) וניסויים גדולים יותר יכולים להיות במהירות ביחס לניתוח נתונים. כדי להקל על עיבוד, הדמיה חזותית וייעול הניתוח של נתונים אלה, נבנתה תוכנית לחיתוך והכנה של עוברים ולביצוע שלבי עיבוד מקדים (אופציונלי) ומאקרו ImageJ המבצע הידור של הנתונים כדי לפשט את הצפייה. ניתן להשתמש בתוכניות אלה כדי לעבד תמונות שנאספו באמצעות גישות קונבנציונליות, מאחר שהן אינן תלויות בשיטת הדימות, ודורשות רק מטוס ביביואלי יחיד. התוכנית הראשונה מקבלת בשדה 4D המכיל עוברים מרובים (אפשרות GUI או קוד מקור embryoCrop.py) או שדות 4D מרובים המכילים עוברים מרובים (screenCrop.py), גידולים הדוקים העוברים וכיוון אותם בתצורה האחורי הקדמי. תוכניות אלה גם נותנות למשתמשים אפשרות לבצע חיסור רקע, תיקון סחיפה ותיקון החליש. הקבצים המתקבלים הם אחיד מעובד מראש, חיתוך היטב בערימות tiff עבור כל עובר הamendable לניתוח תמונה אוטומטית. כדי להפוך את זה לפשוט יותר להציג את כל העוברים עבור כל תנאי, מאקרו ImageJ (OpenandCombine_embsV2. ijm) נכתב, אשר מרכיב את כל העוברים מתנאי נתון לתוך מחסנית אחת tiff ומערכים ברייטפרופילד תמונות וצבע הקרנה מקסימלית העוצמה ( RGB) כיסויי שכבות, זה לצד זה, לכל עובר. השיטות היו מאומת על ידי שימוש בהם כדי לאפיין את הפיתוח העובריים לאחר הדפיקה של 40 בעבר-תיאר גנים התפתחותיים בזוג זנים בנוי אישית המבטא סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של הנבט-שכבה מפרט ומורפוגנזה10,11. יחד עם זאת, העברת התפוקה למחצה וכלים לעיבוד התמונה מאפשרים ניסויים במספר גבוה יותר ומאמצי הקרנה בקנה מידה גדול המיועדים להבנת תהליכים התפתחותיים. בנוסף, זנים אלה יספק גם אמצעי יעיל לבדיקת ההשפעות של רטבאליות מולקולרית על embryogenesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

ג. אלגיה היא המערכת המובילה לניתוח שיטתי של מפרט הגורל התא ואירועים מורפולגנטיים במהלך התפתחות עובריים. אתגר אחד הוא שembryogenesis דינמי נפרש על פני תקופה של כ -13 שעות; זה חצי ציר זמן אורך היום יש להגביל את היקף הניסויים על ידי הגבלת מספר העוברים שניתן לדימות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חצי-גבוה-תפוקה המאפשרת הדמיה בזמן התלת-ממד הסימולטני של פיתוח ב-80-100 עוברים ברזולוציה מתונה, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת ללילה. הפרוטוקול הוא פשוט יכול להיות מיושם על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם היכולת לבקר הנקודה. השירות של פרוטוקול זה מוכח על ידי שימוש בו לתמונה שני זנים בנויים אישית ביטוי סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של שכבת נבט מפרט מורפולגנזה. כדי לנתח את הנתונים, תוכנית מותאמת אישית החותכת את העוברים הבודדים משדה רחב יותר של תצוגה בכל הערוצים, z-steps ונקודות זמן ושומרת את הרצפים עבור כל עובר לתוך מחסנית tiff נפרדת. התוכנית, הכוללת ממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש (GUI), מפשט עיבוד נתונים על ידי בידוד, טרום עיבוד, ו בצורה אחידה עוברים בודדים לקראת ויזואליזציה או ניתוח אוטומטי. שסופקו גם היא מאקרו ImageJ המבצע הידור של נתוני העובר בודדים לתוך קובץ מרובה חלוניות המציג הקרנה בעוצמה מירבית של הקרנת הקרינה ותמונות ברייטפילד לכל עובר בכל נקודה. הפרוטוקולים והכלים המתוארים במסמך זה אומתו באמצעות השימוש בהם לאפיון התפתחות עובריים בעקבות ה40 של הגנים ההתפתחותיים שתוארו לעיל; ניתוח זה דמיינו לעיל פנוטיפים התפתחותיים וחשף חדשים. לסיכום, עבודה זו מפרטת שיטת הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה ביחד עם תוכנית חיתוך ו-ImageJ הכלי להדמיה, כאשר בשילוב עם זנים המבטא פלורסנט אינפורמטיבי סמנים, מאיצה מאוד ניסויים לנתח פיתוח עובריים.

אתגר משמעותי באפיון ההשפעה של רטבאליות מולקולרית על ההתפתחות העובריים של ה -"אלגיה " היא שלוקח כ-10 שעות להתקדם מהמחשוף הראשון ועד לסוף התארכות ב -20 °16. שיטה בעלת תפוקה מלאה למחצה שבה יכולות להיות הדמיה של קבוצות גדולות של עוברים בו, שימושיות לאירועים בקנה מידה זה, משום שהיא ...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

עובר C.elegans לוקח בערך 13 שעות, והוא מנוטר בדרך כלל על ידי צילום עובר אחד בכל פעם. הפרוטוקול שלנו, לעומת זאת, מאפשר הדמיה בו זמנית זמן לשגות תלת מימד של 80 עד 100 עוברים. היכולת לאסוף נתונים עבור מספר רב של עוברי C.elegans מתפתחים פותחת מגוון חדש של ניסויים, כולל ניתוח כמותי של אירועים התפתחותיים ומסכים בקנה מידה גדול.פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות כדי ללכוד תהליכים התפתחותיים שונים או עוברי תמונה המבטאים כל שילוב של סמנים ברקמות מעניינות. זה מאתגר לפזר כראוי את העוברים בתוך בארות. הם צריכים להיות קרובים זה לזה כדי לאפשר לכידה של עוברים מרובים לכל שדה מבלי להצתב במישורי Z שונים.אנו ממליצים להשתמש בשני חוקרים לצורך ניתוח זה לצד זה, על קרח וחסימת בארות שאינן בשימוש. אנו גם להדגים כמה טריקים שימושיים להגדרת במהירות צלחת מבוים היטב 384 היטב. התחל על ידי איטום צלחת 384 היטב עם תחתית זכוכית עם נייר דבק PCR כדי להסוות בארות שאינן שימוש.השתמש סכין גילוח או אזמל כדי לחתוך את רדיד כדי לחשוף תת קבוצה של בארות לשימוש. מוסיפים 70 מיקרוליטרים של TMHC טרי מוכן לתוך כל באר ולשמור את הצלחת על קרח. אל תכלול את שתי השורות החיצוניות של הלוח כדי למנוע אפקטי קצה.להכנת מדגם מהיר, ניתוח זה לצד זה על ידי שני חוקרים מומלץ. כאשר כל הפתרון כבר מצופה, להשתמש פינצטה בסדר מיקרוסקופ ניתוח להעביר כ 10 מבוגרים gravid לתוך 150 microliters של פתרון TMHC קר כקרח בתוך שקופית דיכאון אחת לכל מצב. באמצעות פינצטה ואזמל, לנתח את התולעים כדי לשחרר את העוברים ולהעמיס פיפטה נימי משך לתוך שאפתן הפה.השתמש פיפטה הפה להעביר את כל שני עד שמונה תאים בשלב עוברים לתוך בארות בודדות של הצלחת מוכנה ולבחון את הצלחת כדי לאשר כי אין אגרגטים נמצאים בתוך כל בארות. כאשר כל העוברים נאספו, ליישב את הדגימות על ידי צנטריפוגה ולהשתמש לנגב ספוג אתנול כדי להסיר כל שאריות מתחתית הצלחת. מניחים את הצלחת במחזיק הצלחת של מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולהשתמש במטרה 10X לבצע סריקה מראש של כל באר כדי לזהות שדות עם עוברים מתאימים.בסיום הסריקה, עבור למטרה 60X, להתאים את מישור המוקד בכל נקודה לתמונה אחד עד ארבעה שדות ל הבאר ולרכוש 18 Z-sections בשני מרווחי מיקרומטר כל 20 דקות במשך 10 שעות. כאשר כל התמונות נרכשו, לבצע נמוך, סריקה שדה בהיר היטב, כ 20 עד 24 שעות לאחר תחילת הדמיה לילה כדי להעריך את הקטלניות העוברית. לחיתוך אוטומטי באמצעות קובץ הפעלה embryoCropUI, הורד תחילה את התוכנית זינודו ואת האשכים.zip כדי לקבוע אם התוכנית מתפקדת כראוי על הפלטפורמה. לאחר ההורדה, לפתוח ולנווט כדי למצוא את קובץ ההפעלה embryoCropUI ולחץ פעמיים כדי להפעיל את התוכנית. בחרו 'פתח' לטעינת שדה התצוגה הדו-מימדי הספציפי הראשון לחיתוך.בעת חיתוך סידרת TIFF עם ממדים מרובים, טען רק את התמונה הראשונה בסדרה שבתוכו. לאחר שכל התמונות נטענו, ציינו את פרמטרי ההדמיה, בחרו חיסור רקע ותיקון ההתשה, והגדירו את סדר איסוף התמונות ואת המיקרונים לפיקסל. לאחר מכן בחר הפעלה, ייווצר חיתוך חדש עם תווית של תיקיית משנה באותו נתיב שבו תיווצר התיקיה שלא נחתכה והגירסאות החתוכה יישמרו במיקום זה.לפריטים חזותיים, הורד את התוסף הפתוח והמשולב MSV2 ImageJ ואת הוראות ממשק המשתמש הגרפי Zenodorepov2. docx מ Zenodo ולפתוח את התוסף ב- IMageJ. אתר את קווים 3 ו- 4 והקלט את המיקום שבו יאוחסנו תיקיות התמונות לאחר החיתוך.שמות תיקיית התמונות של התנאים שיש לעבד והמזהה האלפאנומרי הייחודי עבור כל ניסוי בן לילה. לאחר הזנת כל המידע, לחץ על הפעל. יופיע חלון שי להפעיל בקשה לנווט לתיקיה החיצונית המכילה את תיקיות התמונות שנחתכה.לאחר שנבחר חלון אחר יופיע אשר יאפשר מפרט של פרמטרי ההדמיה. לחץ על אישור. הקובץ המורכב יתחיל להתאסף.כאשר נוצר ללא הפרדות צבע, סקור את הקבצים שנותרו פתוחים. כאשר תמונה בשילוב זני כתב מותאם אישית לספק readouts אינפורמטיבי עבור רוב האירועים ההתפתחותיים העיקריים. כולל מפרט סולפט, אינטרקלציה הגבית, מארז אפידרמיס, התארכות ונוירוגנזה.24 שעות לאחר ההזרקה היא נקודת זמן אופטימלית להדמיה. נכון לזמן זה דלדול חלבון אימהי ועיכוב של ביטוי גנים זיגוטיים הם שניהם יעילים מניבים ייחודי, פנוטיפים חתימה מאוד להתרבות על פני קשת רחבה של גנים המעורבים מפרט סולפט ומורפוגנזה. חשוב להיות סבלניים במהלך שלבי הניתוח ובחירת העוברים.מזעור הגושים ובחירת מישורי המוקד המתאימים חיוניים גם להבטחת נתונים באיכות גבוהה. הפרוטוקול שלנו יכול להתבצע עם מגוון רחב של זנים סמן פלואורסצנטי בשילוב עם RNAi או מוטציות. כלי העיבוד שלנו מאפשרים ניתוח נתונים יעיל, אוטומטי או ידני.באמצעות הזנים, השיטות וה הכלים המתוארים כאן הקבוצה שלנו ביצעה מסך תוכן גבוה מבוסס RNAi המכוון לכ-2,000 גנים הדרושים להתפתחות עוברית. שיטות תפוקה גבוהות למחצה היו חיוניות לפרויקט זה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...