Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O. è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences-sponsorizzato University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. e K.O. sono stati sostenuti dal Ludwig Institute for Cancer Research, che ha anche fornito loro finanziamenti per la ricerca utilizzati per sostenere questo lavoro. Siamo grati a Andrew Chisholm per i suoi consigli nelle prime fasi di questo progetto, Ronald Biggs per i contributi a questo progetto dopo la fase iniziale di sviluppo del metodo, e Dave Jenkins e Andy Shiau per il supporto e l'accesso alla Small Molecule Discovery sistema di imaging ad alto contenuto del gruppo.

1. Preparazione di C. elegans Embrioni per l'imaging semi-alto a velocità effettiva
 NOT:</</c0> L'obiettivo di questa parte del protocollo è quello di caricare una popolazione di embrioni C. elegans semi-sincronizzati (da 2 a 8 celle), sezionati da ceppi di pennarelli adatti (Figura 2), in una piastra di 384 pozzetti con fondo di vetro per l'imaging. Anche altri formati di lamiere potrebbero funzionare, ma le 384 lastre di pozzo sono pre...

<ol>
	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

Questo lavoro descrive una suite di strumenti e metodi che sono stati sviluppati per consentire sforzi su larga scala per profilare la funzione dei geni nello sviluppo embrionale in C. elegans. Il nostro metodo semi-alto-velocità consente l'imaging 3D time-lapse dello sviluppo embrionale a 20 minuti di risoluzione per 80-100 embrioni in un unico esperimento. Sebbene questo protocollo possa essere adattato per l'uso con qualsiasi ceppo o ceppo di marcatori desiderato, questo lavoro dimostra il potenziale del met...

L'embrione di C. elegans è un importante sistema modello per la biologia delle cellule meccanicistiche e l'analisi delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici che guidano lo sviluppo embrionale1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Fino ad oggi, gran parte della caratterizzazione sia degli eventi a livello cellulare che delle specifiche del destino cellulare nell'embrione è stata ottenuta utilizzando esperimenti di imaging uno alla volta relativamente ad alta risoluzione temporale (cioè acquisizioni ogni 10-100 s) di embrioni che esprimono fluorescenti. Anche se adatto per eventi in ordine da secondi a decine di minuti, questo approccio diventa tecnicamente limitante per la caratterizzazione di processi più lunghi, nell'ordine di ore a giorni. Lo sviluppo embrionale dalla prima scissione fino alla fine dell'allungamento richiede circa 10 h. A questo ritmo temporale, metodi semi-alti che consentirebbero l'imaging simultaneo a risoluzione temporale più bassa (cioè l'acquisizione a intervalli di tempo di 5-20 min) di coorti di embrioni più grandi, a diverse condizioni, avrebbero aperto una nuova serie di esperimenti; ad esempio, consentendo sforzi sistematici di screening su larga scala e l'analisi di un numero sufficiente di embrioni per confrontare le conseguenze delle perturbazioni molecolari.
Qui, descriviamo un metodo semi-alto per il monitoraggio dell'embriogenesi C. elegans che consente l'imaging time-lapse simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni, da un massimo di 14 condizioni diverse, in un'unica esecuzione notturna. Il protocollo è semplice da implementare e può essere eseguito da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di point visiting. I passaggi principali di questo protocollo sono descritti nella Figura 1. In breve, gli embrioni vengono sezionati da adulti gravidi a predare che esprimono marcatori fluorescenti di interesse e trasferiscono embrioni giovani (stadio cellulare 2-8) a pozzi di una piastra di 384 pozze per l'imaging. In questo formato, le dimensioni relativamente piccole dei pozzi incanalano gli embrioni in un'area stretta, che facilita l'identificazione di campi contenenti più embrioni per l'imaging time-lapse. Per mantenere lo sviluppo approssimativamente sincrono attraverso la coorte di embrioni, le dissezioni vengono eseguite in supporti refrigerati e la piastra viene tenuta sul ghiaccio, il che impedisce uno sviluppo significativo durante la finestra temporale di dissezione della durata di un'ora. La piastra viene trasferita al microscopio e gli embrioni vengono filmati in una stanza a temperatura controllata durante la notte, a intervalli di tempo di 20 min, utilizzando una lente 60x di immersione dell'olio 1,35 NA, per raccogliere l'intera gamma z in 2 gradini. Cinquanta campi, ciascuno contenente tra 1 e 5 embrioni, sono immagine in un'unica pernottamento. A seconda dell'esperimento desiderato, la risoluzione del tempo potrebbe essere aumentata (ad esempio, l'imaging a intervalli da 5 a 10 min) diminuendo proporzionalmente il numero di campi immagine.
Con questo protocollo, anche una singola esecuzione notturna genera una notevole quantità di dati (80-100 embrioni distribuiti su 50 campi) e esperimenti più grandi possono diventare rapidamente ingestibili per quanto riguarda l'analisi dei dati. Per facilitare l'elaborazione, la visualizzazione e semplificare l'analisi di questi dati, è stato costruito un programma per ritagliare e orientare gli embrioni ed eseguire passaggi di pre-elaborazione (opzionale), e una macro ImageJ che compila i dati per semplificare la visualizzazione. Questi programmi possono essere utilizzati per elaborare immagini raccolte utilizzando approcci convenzionali, in quanto sono indipendenti dal metodo di imaging, che richiedono un solo piano di campo luminoso. Il primo programma prende in un campo 4D contenente più embrioni (opzione GUI o codice sorgente embryoCrop.py) o più campi 4D contenenti più embrioni (screenCrop.py), ben da muntire embrioni e li orienta in una configurazione anteriore-posteriore. Questi programmi offrono inoltre agli utenti la possibilità di eseguire la sottrazione in background, la correzione della deriva e la correzione dell'attenuazione. I file risultanti sono uniformemente pre-elaborati, impilati tiff strettamente tagliati per ogni embrione che sono modificabili per l'analisi automatica delle immagini. Per rendere più semplice visualizzare tutti gli embrioni per ogni condizione, è stata scritta una macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), che assembla tutti gli embrioni da una determinata condizione in un unico stack tiff e array immagini luminose e colore di proiezione massima intensità ( RGB) sovrapposizioni, affiancate, per ogni embrione. I metodi sono stati convalidati usandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale dopo aver abbattuto 40 geni di sviluppo descritti in precedenza in una coppia di ceppi fluorescenti personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave dello strato di germinale specifiche e morfogenesi10,11. Insieme, il protocollo di imaging embrionale semi-alto e gli strumenti di elaborazione delle immagini consentiranno esperimenti con numero di campioni più elevato e sforzi di screening su larga scala volti a comprendere i processi di sviluppo. Inoltre, questi ceppi forniranno anche un mezzo efficiente per esaminare gli effetti delle perturbazioni molecolari sull'embriogenesi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

C. elegans è il sistema principale per l'analisi sistematica delle specifiche del destino cellulare e degli eventi morfogenetici durante lo sviluppo embrionale. Una sfida è che l'embriogenesi si sviluppa dinamicamente in un periodo di circa 13 h; questa scala cronologica di mezza giornata ha limitato la portata degli esperimenti limitando il numero di embrioni che possono essere immagine. Qui, descriviamo un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging time-lapse 3D simultaneo dello sviluppo in 80-100 embrioni a risoluzione temporale moderata, da un massimo di 14 condizioni diverse, in una singola esecuzione notturna. Il protocollo è semplice e può essere implementato da qualsiasi laboratorio con accesso a un microscopio con capacità di visita del punto. L'utilità di questo protocollo è dimostrata usandola per immaginare due ceppi personalizzati che esprimono marcatori fluorescenti ottimizzati per visualizzare gli aspetti chiave della specifica e della morfogenesi dello strato germinale. Per analizzare i dati, è stato costruito un programma personalizzato che ritaglia singoli embrioni da un campo visivo più ampio in tutti i canali, i passi z e i punti temporali e salva le sequenze per ogni embrione in una pila tiff separata. Il programma, che include un'interfaccia utente grafica (GUI) intuitiva, semplifica l'elaborazione dei dati isolando, pre-elaborazione e orientando uniformemente i singoli embrioni in preparazione per la visualizzazione o l'analisi automatizzata. Viene fornita anche una macro ImageJ che compila i dati dei singoli embrioni in un file multi-pannello che visualizza la proiezione della fluorescenza massima e immagini del campo luminoso per ogni embrione in ogni punto di tempo. I protocolli e gli strumenti descritti nel presente file sono stati convalidati utilizzandoli per caratterizzare lo sviluppo embrionale a seguito di 40 geni dello sviluppo descritti in precedenza; questa analisi ha visualizzato fenotipi dello sviluppo precedentemente annotati e ne ha rivelato di nuovi. In sintesi, questo lavoro descrive in dettaglio un metodo di imaging semi-alto-velocità accoppiato con un programma di ritaglio e uno strumento di visualizzazione ImageJ che, se combinato con ceppi che esprimono marcatori fluorescenti informativi, accelera notevolmente gli esperimenti da analizzare sviluppo embrionale.

Una sfida significativa nel caratterizzare l'effetto delle perturbazioni molecolari sullo sviluppo embrionale di C. elegans è che ci vogliono circa 10 h per gli embrioni per progredire dalla prima scissione alla fine dell'allungamento a 20 .16. Un metodo semi-alto in cui grandi coorti di embrioni possono essere imagete simultaneamente è utile per gli eventi su questa scala temporale perché consente l'imaging di più condizioni in parallelo con una dimensione sufficiente dell'ensemble p...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

L'embriogenesi C.elegans dura circa 13 ore e di solito viene monitorata filmando un embrione alla volta. Il nostro protocollo, tuttavia, consente l'imaging 3D simultaneo time lapse di 80-100 embrioni. La capacità di raccogliere dati per un gran numero di embrioni C.elegans in via di sviluppo apre una nuova gamma di esperimenti, tra cui l'analisi quantitativa di eventi di sviluppo e schermi su larga scala.Questo protocollo può essere facilmente adattato per catturare diversi processi di sviluppo o per immaginare embrioni che esprimono qualsiasi combinazione di marcatori nei tessuti di interesse. È difficile disperdere correttamente gli embrioni all'interno dei pozzi. Dovrebbero essere vicini per consentire la cattura di più embrioni per campo senza grumi in diversi piani Z.Si consiglia di utilizzare due ricercatori per la dissezione affiancata, sul ghiaccio, e di bloccare i pozzi inutilizzati. Dimostreremo anche alcuni trucchi utili per impostare rapidamente una piastra ben messa in scena da 384 pozzi. Inizia sigillando una piastra con fondo di vetro da 384 po 'con foglio adesivo PCR per mascherare i pozzi inutilizzati.Utilizzare un rasoio o bisturi per tagliare il foglio per esporre un sottoinsieme dei pozzi per l'uso. Aggiungere 70 microlitri di TMHC appena preparato in ogni pozzo e tenere la piastra sul ghiaccio. Escludere le due file esterne della piastra per evitare effetti sui bordi.Per una rapida preparazione del campione, si raccomanda la dissezione affiancata da parte di due ricercatori. Quando tutta la soluzione è stata placcata, utilizzare pinzette fini e un microscopio a dissezione per trasferire circa 10 adulti gravidi in 150 microlitri di soluzione TMHC ghiacciata all'interno di uno scivolo di depressione per condizione. Usando le pinzette e un bisturi, sezionare i vermi per rilasciare gli embrioni e caricare una pipetta capillare tirata in un aspiratore di bocca.Utilizzare la pipetta della bocca per trasferire tutti gli embrioni da due a otto cellule in singoli pozzi della piastra preparata ed esaminare la piastra per confermare che non sono presenti aggregati all'interno di alcun pozzo. Una volta raccolti tutti gli embrioni, depositare i campioni mediante centrifugazione e utilizzare una salvietta imbevuta di etanolo per rimuovere eventuali residui dal fondo della piastra. Posizionare la piastra nel supporto della piastra di un microscopio confocale dotato di un ambiente a temperatura controllata e utilizzare l'obiettivo 10X per eseguire una pre-scansione di ogni pozzo per identificare i campi con embrioni adatti.Al termine della scansione, passare all'obiettivo 60X, regolare il piano focale in ogni punto per l'immagine da uno a quattro campi per pozzo e acquisire 18 sezioni Z a intervalli di due micrometri ogni 20 minuti per 10 ore. Una volta acquisite tutte le immagini, eseguire una scansione bassa, completamente ben illuminata, circa 20-24 ore dopo l'inizio dell'imaging notturno per valutare la letalità embrionale. Per il ritaglio automatico utilizzando l'eseguibile embryoCropUI, scaricare prima il programma da Zenodo e i testfile.zip per determinare se il programma funziona correttamente sulla piattaforma. Una volta scaricato, decomprimere e navigare per trovare il file eseguibile embryoCropUI e fare doppio clic per avviare il programma. Selezionare Apri per caricare il primo campo visivo 4D specifico da ritagliare.Quando si ritaglia una serie TIFF con più dimensioni, caricare solo la prima immagine della serie all'interno della cartella. Una volta caricate tutte le immagini, specificare i parametri di imaging, selezionare la correzione della sottrazione e dell'attenuazione dello sfondo e impostare l'ordine di raccolta delle immagini e i micron per pixel. Quindi selezionare Esegui, verrà creata una nuova sottocartella etichettata crop nello stesso percorso della cartella non ritagliata e le versioni ritagliate verranno salvate in questo percorso.Per la visualizzazione, scaricare il plug-in MSV2 ImageJ aperto e combinato e le istruzioni dell'interfaccia utente grafica Zenodorepov2. docx da Zenodo e aprire il plugin in IMageJ. Individuare le righe tre e quattro e immettere il percorso in cui verranno archiviate le cartelle immagine dopo il ritaglio.Nomi delle cartelle di immagine delle condizioni da elaborare e identificatore alfanumerico univoco per ogni esperimento overnight. Una volta immesse tutte le informazioni, fare clic su Esegui. Verrà visualizzata una finestra che avvierà una richiesta per passare alla cartella esterna contenente le cartelle di immagini ritagliate.Una volta selezionata, apparirà un'altra finestra che consentirà la specifica dei parametri di imaging. Fare clic su OK. Il file composito inizierà ad essere assemblato.Una volta generato il composito, esaminare i file lasciati aperti. Quando vengono immagini in combinazione, i ceppi di reporter personalizzati forniscono letture informative per la maggior parte dei principali eventi di sviluppo. Inclusa la specifica del solfato, l'intercalazione dorsale, l'involucro epidermico, l'allungamento e la neurogenesi.24 ore dopo l'iniezione è un punto di tempo ottimale per l'imaging. A questo punto l'esaurimento delle proteine materne e l'inibizione dell'espressione genica zigotica sono entrambi efficaci producendo fenotipi distintivi distinti e altamente riproducibili in un ampio spettro di geni coinvolti nella specifica del solfato e nella morfogenesi. È importante essere pazienti durante le fasi di dissezione e selezione degli embrioni.Ridurre al minimo il raggruppamento e la selezione dei piani focali appropriati sono essenziali anche per garantire dati di alta qualità. Il nostro protocollo può essere eseguito con una varietà di ceppi di marcatori fluorescenti e in combinazione con RNAi o mutanti. I nostri strumenti di elaborazione consentono un'analisi dei dati semplificata, automatizzata o manuale.Utilizzando i ceppi, i metodi e gli strumenti descritti qui, il nostro gruppo ha eseguito uno schermo ad alto contenuto basato su RNAi destinato a circa 2.000 geni necessari per lo sviluppo embrionale. I metodi ad altissima produttività erano essenziali per questo progetto.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualizzazione di condrociti intercalazione e direzionale proliferazione via Zebrabow Analisi cellulare clonale nella cartilagine del Embryonic Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Trascrittoma Profiling di<em&gt; In-Vivo</em&gt; Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Un metodo semplice per identificare le cinasi che regolano la pluripotenza delle cellule staminali embrionali mediante screening di inibitori ad alta percentuale

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Analisi computazionale della linea germinale Caenorhabditis elegans di studiare la distribuzione dei Nuclei, le proteine ed il citoscheletro

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...