Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O.는 캘리포니아 샌디에이고 대학이 후원하는 국립 의학 연구소의 지원을 받았습니다 (NIH / IRACDA K12 GM068524). A.D.와 K.O.는 루드비히 암 연구소의 지원을 받았으며, 이 연구소는 이 연구를 지원하는 데 사용되는 연구 자금을 제공했습니다. 우리는이 프로젝트의 초기 단계에서 그의 조언에 대한 앤드류 Chisholm에 감사드립니다, 초기 방법 개발 단계 후이 프로젝트에 기여에 대한 로널드 빅스, 지원 및 소분자 발견에 대한 액세스 데이브 젠킨스와 앤디 시아우 고콘텐츠 이미징 시스템.

1. 세미 하이 처리량 이미징을 위한 C. 예쁜꼬마선충 배아 준비
참고: 프로토콜의 이 부분의 목표는 반 동기화 (2 to 8 세포 단계) C. 예쁜꼬마선의 집단을 적절한 마커 균주로부터 해부하는 것입니다(그림 2),이미징을위한 유리 바닥 384 웰 플레이트. 그밖 격판덮개 는 또한 작동할 수 있었습니다, 그러나 작은 우물 크기가 시간 경과 ?...

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	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

이 작품은 C. elegans에있는 배아 발달에 있는 유전자의 기능을 프로파일링하기 위하여 더 큰 규모의 노력을 가능하게 하기 위하여 개발된 공구 및 방법의 제품군을 기술합니다. 우리의 반 높은 처리량 방법은 단일 실험에서 80-100 배아에 대한 20 분 해상도에서 배아 발달의 3D 시간 경과 이미징을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 원하는 마커 균주와 함께 사용하도록 적응 될 수 있지만,이 작품은...

상기 C. elegans 배아는 기계론적 세포 생물학 및 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건의 분석을 위한 중요한 모델 시스템으로 배아발달을 유도하는 1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. 현재까지, 배아에서 세포 수준 사건 및 세포 운명 명세둘 다의 특성의 다량은 상대적으로 높은 시간 별 화상 진찰 실험을 사용하여 달성되었습니다 (즉, 10-100 s마다 취득) 배아발 발현 형광 마커. 초에서 수십 분의 순서로 이벤트에 적합하지만 이 방법은 기술적으로 더 긴 프로세스의 특성화에 대해 몇 시간에서 며칠로 제한됩니다. 연신장의 끝에 첫번째 절단에서 배아 발달은 대략 10 시간 걸립니다. 이 시점에서, 동시 낮은 시간 해상도 이미징을 허용 하는 반 높은 처리량 방법 (즉, 5-20 분 시간 간격에서 취득) 배아의 더 큰 코호트, 다른 조건에서, 실험의 새로운 범위를 열 것 이다; 예를 들면, 체계적인 대규모 검열 노력을 가능하게 하고 분자 섭란의 결과의 비교를 위한 태아의 충분한 수의 분석.
여기에서, 우리는 C. elegans 배아 발생을 감시하기 위한 반 높은 처리량 방법을 기술합니다 80-100배아에 있는 발달의 동시 3D 시간 경과 화상 진찰을 가능하게 하는, 14개의 다른 조건까지, 단 하나 밤새 실행에서. 이 프로토콜은 구현이 간단하며 포인트 방문 기능이있는 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에설명되어 있습니다. 간단히 말해서, 배아는 관심의 형광 마커를 발현하고 젊은 배아 (2-8 세포 단계)를 화상 진찰을 위한 384 웰 판의 우물로 옮기는 gravid 성인에게서 해부됩니다. 이 형식에서는, 상대적으로 작은 잘 크기는 시간 경과 화상 진찰을 위한 다중 배아를 포함하는 필드의 확인을 용이하게 하는 좁은 지역으로 배영을 깔때기. 배아 의 코호트에 걸쳐 대략 동기 발달을 유지하기 위해, 해부는 차가운 매체에서 수행되고 플레이트는 1 시간 긴 해부 시간 기간 동안 중요한 발달을 방지 얼음에 개최됩니다. 플레이트는 현미경으로 이송되고 배아는 60x 오일 침지 1.35 NA 렌즈를 사용하여 20 분 간격으로 밤새 온도 제어 실에서 촬영되어 2 μm 단계에서 전체 z 범위를 수집합니다. 1-5개의 배아를 포함하는 각각 50개의 필드는, 한 번의 하룻밤 실행에서 심상됩니다. 원하는 실험에 따라 이미지 필드 수를 비례적으로 줄임으로써 시간 해상도(예: 5-10분 간격으로 이미징)를 늘릴 수 있습니다.
이 프로토콜을 사용하면 하룻밤 동안 실행해도 상당한 양의 데이터(50개 필드에 분산된 80~100개의 배아)를 생성하며, 더 큰 실험은 데이터 분석과 관련하여 빠르게 관리하기 가 불가능해질 수 있습니다. 이 데이터의 처리, 시각화 및 분석을 용이하게 하기 위해 배아를 자르고 방향을 조정하고 전처리 단계(선택 사항)를 수행하고 데이터를 컴파일하여 보기를 단순화하는 ImageJ 매크로를 수행하는 프로그램이 구축되었습니다. 이러한 프로그램은 이미징 방법과 무관하므로 단일 브라이트필드 평면만 필요로 하기 때문에 기존의 접근 방식을 사용하여 수집된 이미지를 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 첫 번째 프로그램은 여러 배아 (GUI 옵션 또는 소스 코드 embryoCrop.py) 또는 여러 배아 (screenCrop.py)를 포함하는 여러 4D 필드를 포함하는 4D 필드에서, 단단히 배아를 작물과 전방 후방 구성에서 방향을 지정합니다. 또한 이러한 프로그램은 사용자에게 배경 감속, 드리프트 보정 및 감쇠 보정을 수행할 수 있는 옵션을 제공합니다. 결과 파일은 자동화된 이미지 분석으로 수정가능한 각 배아에 대해 균일하게 사전 처리되고 단단히 잘려진 티프 스택입니다. 각 조건에 대한 모든 배아를 더 간단하게 볼 수 있도록 ImageJ 매크로(OpenandCombine_embsV2.ijm)가 작성되어 주어진 상태의 모든 배아를 단일 티프 스택으로 조립하고 밝은 필드 이미지와 최대 강도 프로젝션 색상을 배열합니다. RGB) 각 배아에 대해 나란히 오버레이합니다. 이 방법은 배아 층의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 발현하는 한 쌍의 사용자 정의 내장 균주에서 40 개의 이전에 설명 된 발달 유전자를 노크 한 후 배아 발달을 특성화하는 데 사용함으로써 검증되었습니다. 사양 및 형태 형성10,11. 함께, 세미 높은 처리량 배아 이미징 프로토콜 및 이미지 처리 도구는 개발 프로세스를 이해하기위한 더 높은 샘플 수 실험및 대규모 선별 노력을 가능하게 할 것이다. 또한, 이러한 균주는 또한 배아 발생에 대한 분자 교란의 효과를 검사하기위한 효율적인 수단을 제공 할 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

C. 예쁜꼬마선충은 배아 발달 중 세포 운명 명세서 및 형태유전학적 사건을 체계적으로 분석하기 위한 최고의 시스템입니다. 한 가지 과제는 배아 발생이 약 13시간 동안 동적으로 전개된다는 것입니다. 이 반나절 긴 기간 척도는 이미지화 할 수있는 배아의 수를 제한하여 실험의 범위를 제한했습니다. 여기에서는 중간 시간 해상도에서 최대 14개의 다른 조건에서 단일 하룻밤 실행에서 80-100개의 배아에서 동시에 3D 시간 경과 이미징을 허용하는 반 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 간단하며 지점 방문 용량을 갖춘 현미경에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 구현 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 유용성은 세균 층 명세서 및 형태 형성의 주요 측면을 시각화하기 위해 최적화 된 형광 마커를 표현하는 두 개의 맞춤형 균주를 이미지화하는 데 사용함으로써 입증됩니다. 데이터를 분석하기 위해 모든 채널, z-스텝 및 타임포인트에서 개별 배아를 더 넓은 시야에서 자르는 사용자 지정 프로그램을 구축하고 각 배아에 대한 서열을 별도의 티프 스택으로 저장합니다. 사용자 친화적인 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 포함하는 이 프로그램은 시각화 또는 자동화된 분석을 준비하기 위해 개별 배아를 분리, 전처리 및 균일하게 방향을 지정하여 데이터 처리를 간소화합니다. 또한 각 배아의 최대 강도 형광 투영 및 각 배아의 밝은 필드 이미지를 표시하는 다중 패널 파일로 개별 배아 데이터를 컴파일하는 ImageJ 매크로가 제공됩니다. 본 원에 기재된 프로토콜 및 도구는 이전에 기술된 40개의 발달 유전자의 노크다운 에 따른 배아 발달을 특성화하기 위해 이를 사용하여 검증되었다; 이 분석은 이전에 추가된 발달 표현형을 시각화하고 새로운 표현형을 밝혔습니다. 요약하면, 이 작품은 유익한 형광 마커를 표현하는 균주와 결합될 때, 분석하기 위한 실험을 크게 가속화하는 자르기 프로그램 및 ImageJ 시각화 도구와 결합된 반고처리량 이미징 방법을 자세히 설명합니다. 배아 발달.

C. 예쁜꼬마기 배아 발달에 대한 분자 교란의 효과를 특성화하는 데 있어 중요한 과제는 배아가 첫 번째 절단에서 연신기 의 끝에서 20°16에서진행되기까지 약 10 시간이 걸린다는 것입니다. 배아의 큰 코호트가 동시에 이미지화될 수 있는 세미 하이 처리량 방법은 각 조건에 대한 충분한 앙상블 크기와 병렬로 여러 조건의 이미징을 허용하기 때문에 이 시간 규모의 이벤트?...

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A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

C.elegans 태아 발생에 대 한 소요 13 시간, 일반적으로 한 번에 하나의 태아를 촬영 하 여 모니터링. 그러나 우리의 프로토콜은 80-100개의 배아의 동시 3D 시간 경과 이미징을 허용합니다. 많은 수의 C.elegans 배아에 대한 데이터를 수집하는 기능은 발달 이벤트 및 대규모 스크린의 정량 적 분석을 포함하여 새로운 범위의 실험을 엽니다.이 프로토콜은 다양한 발달 과정을 캡처하거나 관심 있는 조직에서 마커의 조합을 표현하는 배아를 이미지화하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 우물 내의 배아를 제대로 분산하는 것은 어렵습니다. 그(것)들은 다른 Z 비행기에 응집하지 않고 필드 당 다중 태아의 포착을 가능하게 하기 위하여 가까이 있어야 합니다.두 명의 연구원을 나란히 해부, 얼음 에 사용하고 사용하지 않은 우물을 차단하는 것이 좋습니다. 우리는 또한 신속하게 잘 준비 384 잘 플레이트를 설정하기위한 몇 가지 유용한 트릭을 보여줍니다. 먼저 사용하지 않은 우물을 가리기 위해 PCR 접착제 호일로 유리 바닥 384웰 플레이트를 밀봉합니다.면도기 나 메스를 사용하여 호일을 잘라 내어 웰의 하위 집합을 노출하십시오. 갓 준비된 70마이크로리터를 각 우물에 넣고 접시를 얼음 위에 보관합니다. 가장자리 효과를 방지하기 위해 플레이트의 외부 두 행을 제외합니다.신속한 샘플 준비를 위해 두 명의 연구원이 나란히 해부하는 것이 좋습니다. 모든 용액이 도금되면 미세 핀셋과 해부 현미경을 사용하여 약 10 명의 중력 성인을 조건당 한 우울증 슬라이드 내에서 얼음 차가운 TMHC 용액 150 마이크로 리터로 전송하십시오. 핀셋과 메스를 사용하여 벌레를 해부하여 배아를 방출하고 당겨지는 모세관 파이펫을 입 흡입기에 넣습니다.구강 파이펫을 사용하여 2~8세포 단계 배아를 모두 준비된 플레이트의 개별 우물로 옮기고 플레이트를 검사하여 어떤 우물 내에 골재가 존재하지 않는지 확인한다. 모든 배아가 수집되면 원심분리에 의해 표본을 정산하고 에탄올에 담근 닦아 플레이트 바닥에서 잔류물을 제거합니다. 온도 조절 환경을 갖춘 공초점 현미경의 플레이트 홀더에 플레이트를 놓고 10X 목표를 사용하여 각 웰의 사전 스캔을 수행하여 적합한 배아를 가진 필드를 식별합니다.스캔이 끝나면 60X 목표로 전환하여 각 지점에서 초점 평면을 조정하여 웰당 1~4개의 필드를 이미지화하고 10시간 동안 20분마다 2마이크로미터 간격으로 18개의 Z 단면을 획득합니다. 모든 이미지가 획득되면, 배아 치사성을 평가하기 위해 밤새 이미징이 시작된 후 약 20~24시간, 저음, 전체적으로 잘 밝은 필드 스캔을 수행합니다. 배아CropUI 실행 파일을 사용하여 자동화 된 자르기의 경우 먼저 제노도와 테스트 파일에서 프로그램을 다운로드하십시오.지퍼는 프로그램이 플랫폼에서 제대로 작동하는지 여부를 결정합니다. 일단 다운로드, 압축을 풀고 탐색 배아CropUI 실행 파일을 찾아 프로그램을 시작 하려면 두 번 클릭. 열려 있는 선택을 선택하여 첫 번째 특정 4D 시야 필드를 자르기 위해 로드합니다.여러 차원의 TIFF 시리즈를 자르면 폴더 내의 계열의 첫 번째 이미지만 로드됩니다. 모든 이미지가 로드되면 이미징 매개 변수를 지정하고 배경 감속 및 감쇠 보정을 선택하고 이미지 수집 순서와 픽셀당 미크론을 설정합니다. 그런 다음 실행을 선택하면 잘라낸 폴더와 동일한 경로에 새 하위 폴더 레이블이 표시된 자르기가 만들어지고 잘라낸 버전이 이 위치에 저장됩니다.시각화를 위해 개방적이고 결합된 MSV2 ImageJ 플러그인 및 그래픽 사용자 인터페이스 지침 Zenodorepov2를 다운로드하십시오. 제노도에서 독과 IMageJ에서 플러그인을 엽니 다. 3줄과 4선을 찾고 자르기 후에 이미지 폴더가 저장되는 위치를 입력합니다.처리할 조건의 이미지 폴더 이름과 각 야간 실험에 대한 고유한 유수 식별자입니다. 모든 정보를 입력한 경우 실행을 클릭합니다. 자른 이미지 폴더가 들어 있는 외부 폴더로 이동하라는 메시지가 나타납니다.선택한 다른 창이 나타나면 이미징 매개 변수의 사양을 허용합니다. 확인을 클릭합니다. 복합 파일이 조립되기 시작합니다.합성이 생성되면 열려 있는 파일을 검토합니다. 사용자 지정 리포터 균주와 함께 이미지화하면 대부분의 주요 발달 이벤트에 대한 유익한 판독을 제공합니다. 황산염 사양, 등변 간연, 표피 인클로저, 신장 및 신경 발생을 포함합니다.주사 후 24 시간은 이미징을위한 최적의 시간 지점입니다. 이 때 모계 단백질 고갈 및 zygotic 유전자 발현의 억제는 황산염 사양 및 형태발생에 관여하는 광범위한 유전자 스펙트럼을 통해 뚜렷하고 재현 가능한 시그니처 표현형을 모두 효과적인 산출한다. 해부 및 배아 선택 단계 동안 인내심을 두는 것이 중요합니다.응집기를 최소화하고 적절한 초점 평면을 선택하는 것도 고품질 데이터를 확보하는 데 필수적입니다. 우리의 프로토콜은 다양한 형광 마커 균주와 RNAi 또는 돌연변이체와 함께 수행 할 수 있습니다. 로크티어처리 툴은 간소화, 자동화 또는 수동 데이터 분석을 가능하게 합니다.여기에 설명된 균주, 방법 및 도구를 사용하여 우리 그룹은 배아 발달에 필요한 약 2, 000 유전자를 대상으로 RNAi 기반의 고함량 스크린을 수행했습니다. 이 프로젝트에는 세미 하이 처리량 방법이 필수적이었습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

연구

발생학

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

의 사체 프로파일 링<em&gt; 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여&gt; 제작 소 착상 전 배아

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...