Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O. ble støttet av National Institute of General Medical Sciences-sponset University of California San Diego institusjonelle forsknings-og akademiske karriere Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. og K.O. ble støttet av Ludwig Institute for Cancer Research, som også ga dem med forskningsmidler brukes til å støtte dette arbeidet. Vi er takknemlige for Andrew Chisholm for hans råd i de tidlige fasene av dette prosjektet, Ronald Biggs for bidrag til dette prosjektet etter den første metoden utviklingsfasen, og Dave Jenkins og Andy Shiau for støtte og tilgang til Small molekyl Discovery gruppens høy-innhold tenkelig system.

1. forbereder C. elegans embryo for semi-høy gjennomstrømming Imaging
Merk: Målet med denne delen av protokollen er å laste en befolkning på semi-synkronisert (2 til 8-celle scenen) C. elegans embryo, dissekert fra egnede markør stammer (figur 2), i et glass-bunn 384-brønn plate for bildebehandling. Andre plateformater kan også fungere, men 384 brønn platene foretrekkes fordi den lille brønn størrelsen begrenser sprednin...

<ol>
	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

Dette arbeidet beskriver en pakke med verktøy og metoder som ble utviklet for å muliggjøre større skala innsats for å Profile funksjonen av gener i embryoutvikling i C. elegans. Vår semi-høy gjennomstrømming metoden tillater 3D time-lapse Imaging av embryoutvikling på 20 min oppløsning for 80-100 embryo i et enkelt eksperiment. Selv om denne protokollen kan tilpasses for bruk med ønsket markør stamme (r), demonstrerer dette arbeidet potensialet i metoden ved hjelp av to tilpassede stammer utviklet fo...

Den C. elegans embryo er en viktig modell system for mekanistisk cellebiologi og analyse av celle skjebne spesifikasjon og Morfogenetiske hendelser kjøring embryoutvikling1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Hittil er mye av karakterisering av både Cellular-Level Events og celle skjebne spesifikasjon i fosteret er oppnådd ved hjelp av relativt høy Temporal oppløsning en-til-en-time Imaging eksperimenter (dvs. oppkjøpet hver 10-100 s) av embryo uttrykke fluorescerende markører. Selv godt egnet for hendelser på rekkefølgen av sekunder til titalls minutter, denne tilnærmingen blir teknisk begrensende for karakterisering av lengre prosesser, på rekkefølgen av timer til dager. Embryonale utviklingen fra første kløft til slutten av forlengelse tar ca 10 h. På denne tidsskala, semi-høy gjennomstrømming metoder som ville tillate samtidig lavere tid oppløsning Imaging (dvs. oppkjøp på 5-20 min tidsintervaller) av større kohorter av embryo, fra ulike forhold, ville åpne opp en ny rekke eksperimenter; for eksempel, muliggjør systematisk storstilt screening innsats og analyse av tilstrekkelig antall embryo for sammenligninger av konsekvensene av molekylær forstyrrelser.
Her beskriver vi en semi-høy gjennomstrømming metode for overvåking C. elegans embryogenesis som muliggjør samtidig 3D time-lapse Imaging av utviklingen i 80-100 embryo, fra opp til 14 ulike forhold, i en enkelt overnatting kjøre. Protokollen er grei å implementere og kan utføres av ethvert laboratorium med tilgang til et mikroskop med punkt besøk evner. De viktigste trinnene i denne protokollen er skissert i figur 1. Kort sagt, embryo er dissekert fra gravid voksne uttrykker fluorescerende markører av interesse og overføre unge embryo (2-8 celle scenen) til brønner av en 384-brønn plate for Imaging. I dette formatet, den relativt liten brønn størrelse trakter embryo inn i et smalt område, noe som forenkler identifisering av felt som inneholder flere embryo for time-lapse Imaging. For å opprettholde omtrent synkron utvikling på tvers av kohort av embryo, er dissections utført i kjølt Media og platen holdes på isen, noe som hindrer betydelig utvikling i løpet av time lange disseksjon tid vinduet. Platen er overført til mikroskopet og embryo er filmet i en temperatur-kontrollerte rom over natten, ved 20 min tidsintervaller, ved hjelp av en 60x olje nedsenking 1,35 NA linse, for å samle hele z-serien i 2 μm trinn. 50 felt, som hver inneholder mellom 1 til 5 embryo, er avbildet i en enkelt overnatting kjøre. Avhengig av det ønskede eksperimentet kan tids oppløsningen økes (for eksempel ved 5 – 10 minutters intervaller) ved å redusere antallet bildefelter proporsjonalt.
Med denne protokollen, selv en eneste natten kjører genererer en betydelig mengde data (80-100 embryo spredt ut over 50 felt) og større eksperimenter kan raskt bli uhåndterlig med hensyn til dataanalyse. For å lette behandlingen, visualisering og effektivisere analysen av disse dataene, ble et program bygget for å beskjære ut og orientere embryo og utføre pre-prosessering trinn (valgfritt), og en ImageJ makro som kompilerer dataene for å forenkle visning. Disse programmene kan brukes til å behandle bilder som er samlet inn ved hjelp av konvensjonelle tilnærminger, som de er uavhengige av tenkelig metode, som krever bare en enkelt brightfield fly. Det første programmet tar i en 4D-feltet som inneholder flere embryo (GUI alternativ eller kildekoden embryoCrop.py) eller flere 4D felt som inneholder flere embryo (screenCrop.py), tett avlinger embryo og orienterer dem i en fremre-bakre konfigurasjon. Disse programmene også gi brukerne muligheten til å utføre bakgrunns subtraksjon, drift korreksjon, og demping korreksjon. Den resulterende filene er jevnt pre-behandlet, tett beskjæres TIFF stabler for hvert embryo som er amendable til automatisert bildeanalyse. For å gjøre det enklere å se alle embryo for hver betingelse, en ImageJ makro (OpenandCombine_embsV2. ijm) ble skrevet, som samler alle embryo fra en gitt tilstand i en enkelt TIFF stack og arrays brightfield bilder og maksimal intensitet projeksjon farge ( RGB)-overlegg, side ved side, for hvert embryo. Metodene ble validert ved å bruke dem til å karakterisere embryoutvikling etter knock-Down av 40 tidligere beskrevet utviklingsmessige gener i et par spesialbygde stammer uttrykke fluorescerende markører optimalisert for å visualisere viktige aspekter av bakterie-lag spesifikasjonog morphogenesis. Sammen vil den semi-høy gjennomstrømming embryo Imaging Protocol og bildebehandling verktøy muliggjør høyere sample antall eksperimenter og stor skala screening innsats som tar sikte på å forstå utviklingsmessige prosesser. I tillegg vil disse stammene også gi et effektivt middel for å undersøke virkningene av molekylær forstyrrelser på embryogenesis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

C. elegans er det fremste systemet for systematisk analyse av celle skjebne spesifikasjon og Morfogenetiske hendelser under embryonale utviklingen. En utfordring er at embryogenesis dynamisk utfolder seg over en periode på ca 13 h; Denne halv dag lange tidsskalaen har begrenset omfanget av eksperimenter ved å begrense antall embryo som kan bli avbildet. Her beskriver vi en semi-høy gjennomstrømming protokoll som gjør det mulig for samtidig 3D time-lapse Imaging av utviklingen i 80-100 embryo ved moderat tid oppløsning, fra opptil 14 forskjellige forhold, i en enkelt overnatting kjøre. Protokollen er grei og kan implementeres av ethvert laboratorium med tilgang til et mikroskop med punkt Besøks kapasitet. Nytten av denne protokollen er demonstrert ved å bruke den til bilde to spesialbygde stammer uttrykke fluorescerende markører optimalisert for å visualisere viktige aspekter av bakterie-lags spesifikasjon og morphogenesis. Å analysere dataene, et egendefinert program som beskjærer individuelle embryo ut av et bredere synsfelt i alle kanaler, z-trinn, og tidspunkter og lagrer sekvensene for hvert embryo i en egen TIFF-stabel ble bygget. Programmet, som inkluderer et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (GUI), effektiviserer databehandling ved å isolere, pre-prosessering, og jevnt orientere individuelle embryo i forberedelse til visualisering eller automatisert analyse. Også leveres er en ImageJ makro som kompilerer individuelle embryo data i en multi-panel fil som viser maksimal intensitet fluorescens projeksjon og brightfield bilder for hvert embryo på hvert tidspunkt. Protokollene og verktøyene som er beskrevet her, ble validert ved å bruke dem til å karakterisere embryonale utviklingen etter knock-Down av 40 tidligere beskrev utviklings gener; Denne analysen viste tidligere kommenterte utviklingsmessige fenotyper og avslørte nye. Oppsummert dette arbeidet detaljer en semi-høy gjennomstrømming imaging metode kombinert med et beskjæring program og ImageJ visualisering verktøy som, når kombinert med stammer uttrykker informative fluorescerende markører, akselererer sterkt eksperimenter for å analysere embryoutvikling.

En betydelig utfordring i karakteriserer effekten av molekylær forstyrrelser på C. elegans embryoutvikling er at det tar ca 10 h for embryo å gå videre fra første kløft til slutten av forlengelse ved 20 °16. En semi-høy gjennomstrømming metode der store kohorter av embryo kan samtidig avbildet er nyttig for hendelser på denne tidsskala fordi den tillater Imaging av flere forhold parallelt med en tilstrekkelig ensemble størrelse for hver betingelse for å muliggjøre kvantitativ...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Dette arbeidet beskriver en protokoll for semi-høy gjennomstrømning som muliggjør samtidig 3D-embryogenesis i 80 – 100 C. elegans embryo i én nattkjøring. I tillegg er bildebehandlings-og visualiseringsverktøy inkludert for å effektivisere dataanalyse. Kombinasjonen av disse metodene med tilpassede reporter stammer muliggjør detaljert overvåking av embryogenesis.

En semi-høy gjennomstrømming imaging metode og data visualisering Toolkit å analysere C. elegans embryonale utvikling

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

C.elegans embryogenese tar ca 13 timer, og overvåkes vanligvis ved å filme ett embryo om gangen. Vår protokoll tillater imidlertid samtidig 3D-tidsforløp av 80 til 100 embryoer. Muligheten til å samle inn data for et stort antall utviklende C.elegans embryoer åpner opp et nytt utvalg av eksperimenter, inkludert kvantitativ analyse av utviklingshendelser og store skjermer.Denne protokollen kan enkelt tilpasses for å fange opp ulike utviklingsprosesser eller til bildeembryoer som uttrykker en kombinasjon av markører i vev av interesse. Det er utfordrende å spre embryoene i brønnene på riktig måte. De bør være tett sammen for å muliggjøre fangst av flere embryoer per felt uten å klumpe seg i forskjellige Z-fly.Vi anbefaler at du bruker to forskere til side-ved-side disseksjon, på is og blokkering av ubrukte brønner. Vi vil også demonstrere noen nyttige triks for raskt å sette opp en godt iscenesatt 384-brønns plate. Begynn med å forsegle en glassbunnet 384-brønnsplate med PCR-klebemiddelfolie for å maskere ubrukte brønner.Bruk en barberhøvel eller skalpell til å kutte bort folien for å eksponere en undergruppe av brønnene for bruk. Tilsett 70 mikroliter nylaget TMHC i hver brønn og hold platen på is. Ekskluder de ytre to radene av platen for å forhindre kanteffekter.For rask prøveforberedelse anbefales side-ved-side disseksjon av to forskere. Når all oppløsningen er belagt, bruk fine pinsett og et disseksjonsmikroskop for å overføre ca 10 gravid voksne til 150 mikroliter iskald TMHC-løsning innenfor en depresjonslysbilde per tilstand. Ved hjelp av pinsett og en skalpell, dissekere ormene for å frigjøre embryoene og laste en trukket kapillær pipette inn i en munnaspirator.Bruk munnpipetten til å overføre alle de to til åtte-celletrinns embryoene til individuelle brønner av den tilberedte platen og undersøke platen for å bekrefte at det ikke finnes aggregater innenfor noen brønner. Når alle embryoene er samlet inn, avgjør prøvene ved sentrifugering og bruker en etanol gjennomvåt klut for å fjerne eventuelle rester fra bunnen av platen. Plasser platen i plateholderen på et konfokalt mikroskop utstyrt med et temperaturkontrollert miljø og bruk 10X-målet til å utføre en forhåndsskanning av hver brønn for å identifisere felt med egnede embryoer.På slutten av skanningen bytter du til 60X-målet, justerer fokusplanet på hvert punkt for å bilde ett til fire felt per brønn og får 18 Z-seksjoner med to mikrometerintervaller hvert 20. Når alle bildene er anskaffet, utfør en lav, helt brønn brightfield scan, ca 20 til 24 timer etter starten av natten bildebehandling for å vurdere embryonale dødelighet. For automatisert beskjæring ved hjelp av embryoCropUI kjørbar, først laste ned programmet fra Zenodo og testfiles.for å finne ut om programmet fungerer som det skal på plattformen. Når lastet ned, pakke ut og navigere for å finne embryoCropUI kjørbar fil og dobbeltklikk for å starte programmet. Velg åpen for å laste inn det første spesifikke 4D-visningsfeltet som skal beskjæres.Når beskjæring av en TIFF-serie med flere dimensjoner laster bare det første bildet i serien i mappen. Når alle bildene er lastet inn, angir du bildeparametrene, velger du subtraksjon i bakgrunnen og dempingskorrigeringen og angir bildesamlingsrekkefølgen og mikronene per piksel. Velg deretter kjør, en ny undermappe merket beskjæring vil bli opprettet i samme bane som den ubeskjærede mappen, og de beskårne versjonene vil bli lagret på denne plasseringen.For visualisering, last ned den åpne og kombinerte MSV2 ImageJ plugin og grafisk brukergrensesnitt instruksjoner Zenodorepov2. docx fra Zenodo og åpne plugin i IMageJ. Finn linje tre og fire, og skriv inn plasseringen der bildemappene skal lagres etter beskjæringen.Bildemappenavnene på betingelsene som skal behandles, og den unike alfanumeriske identifikatoren for hvert eksperiment over natten. Når all informasjonen er angitt, klikker du Kjør. Det vises et vindu som vil starte en melding om å navigere til den ytre mappen som inneholder de beskårne bildemappene.Når valgt et annet vindu vil vises som vil tillate spesifikasjon av bildeparametrene. Klikk ok. Den sammensatte filen begynner å montere.Når komposittet er generert, kan du se gjennom filene som er åpne. Når avbildet i forbindelse med tilpassede reporterstammer gir informative avlesninger for de fleste store utviklingshendelser. Inkludert sulfatspesifikasjon, dorsal intercalation, epidermal kabinett, forlengelse og nevrogenese.24 timer etter injeksjon er et optimalt tidspunkt for bildebehandling. Fra og med denne tiden er maternal proteinuttømming og hemming av zygotisk genuttrykk begge effektive som gir distinkte, svært reproduserbare signaturfenotyper på tvers av et bredt spekter av gener som er involvert i sulfatspesifikasjon og morfogenese. Det er viktig å være tålmodig under disseksjon og embryo valg trinn.Minimere klumping og velge riktig fokale fly er også avgjørende for å sikre data av høy kvalitet. Vår protokoll kan utføres med en rekke fluorescerende markørstammer og i kombinasjon med RNAi eller mutanter. Behandlingsverktøyene våre gir mulighet for strømlinjeformet, automatisert eller manuell dataanalyse.Ved hjelp av stammer, metoder og verktøy som er beskrevet her, utførte gruppen vår en RNAi-basert høyinnholdsskjerm rettet mot ca. 2000 gener som kreves for embryonisk utvikling. Semi-høy gjennomstrømning metoder var avgjørende for dette prosjektet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering av chondrocyttransplantasjon innskyting og Directional spredning via Zebrabow Klonal Cell Analysis i Embryonic Meckels Brusk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produserte Bovine Pre-implantasjon Embryoet ved hjelp av to-farge microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En allsidig monteringsmetode for Long Term Imaging av Sebrafisk Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En enkel metode for å identifisere kinaser som regulerer embryonisk stamcellepluripotens ved høy gjennomstrømningsinhibitor screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flere Foton tid forfalle Imaging se utvikling i sanntid: visualisering av migrere Neural Crest celler i sebrafisk embryo

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans å analysere intracellulær Transport i nerveceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metoden å studere utviklingen av embryonale kylling vev

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropic lys-ark mikroskopi og automatisert Cell Lineage analyser til katalog Caenorhabditis elegans embryogenesis med Subcellulære oppløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...