Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O. stöddes av det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper-sponsrade University of California San Diego institutionell forskning och akademiska karriärutveckling Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. och K.O. stöddes av Ludwig Institutet för cancer forskning, som också gav dem forskningsfinansiering som används för att stödja detta arbete. Vi är tacksamma mot Andrew Chisholm för hans råd i de tidiga faserna av detta projekt, Ronald Biggs för bidrag till detta projekt efter den inledande metoden utvecklingsfasen, och Dave Jenkins och Andy shiau för stöd och tillgång till den lilla molekyl upptäckten koncernens system för hög innehålls avbildning.

1. förbereda C. elegans embryon för semi-högt dataflöde Imaging
Anmärkning: Målet med denna del av protokollet är att läsa in en population av semi-synkroniserade (2 till 8-cellsledet) C. elegans embryon, dissekeras från lämpliga markör stammar (figur 2), i en glasbotten 384-brunn plattan för avbildning. Andra plåtformat kan också fungera, men 384 väl plattorna är att föredra eftersom den lilla storleken begränsar...

<ol>
	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

Detta arbete beskriver en uppsättning verktyg och metoder som utvecklats för att möjliggöra större ansträngningar för att profilera funktionen av gener i embryonal utveckling i C. elegans. Vår semi-högt genomströmning metod tillåter 3D tidsförlopp avbildning av embryonal utveckling vid 20 min upplösning för 80 – 100 embryon i ett enda experiment. Även om detta protokoll kan anpassas för användning med någon önskad markör stam (er), detta arbete visar potentialen av metoden med hjälp av tv?...

C. elegans embryot är ett viktigt modellsystem för mekanistisk cellbiologi och analys av cell öde specifikation och morfogenetiska händelser drivande embryonal utveckling1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Hittills har mycket av karakteriseringen av både cellulära-nivå händelser och cell öde specifikation i embryot uppnåtts med hjälp av relativt hög temporala upplösning en-vid-en-tid bildbehandling experiment (dvs., förvärv varje 10-100 s) av embryon som uttrycker fluorescerande markörer. Även om det lämpar sig väl för händelser i storleksordningen sekunder till tiotals minuter, blir denna metod tekniskt begränsande för karakterisering av längre processer, på order av timmar till dagar. Embryonal utveckling från första klyvning till slutet av förlängningen tar ca 10 h. Vid denna tidsskala, semi-högt genomflöde metoder som skulle möjliggöra samtidig lägre tidsupplösning bildbehandling (dvs., förvärv på 5 – 20 min tidsintervall) av större kohorter av embryon, från olika förhållanden, skulle öppna upp en ny rad experiment; till exempel möjliggöra systematiska storskaliga screening insatser och analys av tillräckligt antal embryon för jämförelser av konsekvenserna av molekylära störningar.
Här beskriver vi en semi-högt genomflöde metod för övervakning C. elegans embryogenes som möjliggör samtidig 3D tidsförlopp avbildning av utvecklingen i 80 – 100 embryon, från upp till 14 olika förhållanden, i en enda övernattning. Protokollet är enkelt att genomföra och kan utföras av alla laboratorier med tillgång till ett Mikroskop med punkt besökande kapacitet. De viktigaste stegen i detta protokoll beskrivs i figur 1. I korthet, embryon dissekeras från dräktiga vuxna uttrycker fluorescerande markörer av intresse och överföra unga embryon (2-8 cell Stadium) till brunnar i en 384-brunn plattan för avbildning. I detta format, den relativt små väl storlek trattar embryon i ett smalt område, vilket underlättar identifieringen av fält som innehåller flera embryon för Time-lapse Imaging. För att bibehålla en ungefär synkron utveckling över kohorten av embryon, är dissektioner utförs i kylda medier och plattan hålls på is, vilket förhindrar betydande utveckling under den timlånga dissektion tidsfönster. Plattan överförs till Mikroskop och embryon är filmade i ett temperaturkontrollerat rum över natten, på 20 min tidsintervall, med hjälp av en 60x oljeimmersion 1,35 NA lins, att samla in hela z-Range i 2 μm steg. 50 fält, som var och en innehåller mellan 1 – 5 embryon, avbildas i en enda övernattning. Beroende på önskat experiment kan tidsupplösningen ökas (t. ex. bildtagning med 5 – 10 minuters mellanrum) genom att proportionellt minska antalet avbildade fält.
Med detta protokoll, även en enda över natten kör genererar en betydande mängd data (80-100 embryon utspridda över 50 fält) och större experiment kan snabbt bli ohanterliga med avseende på dataanalys. För att underlätta bearbetning, visualisering och effektivisera analys av dessa data, ett program byggdes för att beskära ut och orientera embryon och utföra Pre-processing steg (tillval), och en ImageJ makro som sammanställer data för att förenkla visning. Dessa program kan användas för att bearbeta bilder som samlats in med konventionella metoder, eftersom de är oberoende av avbildnings metoden, vilket kräver endast ett enda brightfield-plan. Det första programmet tar i en 4D fält som innehåller flera embryon (GUI alternativ eller källkod embryoCrop.py) eller flera 4D fält som innehåller flera embryon (screenCrop.py), tätt grödor embryon och orienterar dem i en anterior-posterior konfiguration. Dessa program ger också användarna möjlighet att utföra bakgrunds subtraktion, avdrift korrigering, och dämpning korrigering. De resulterande filerna är enhetligt förbehandlade, tätt beskurna TIFF stackar för varje embryo som är tillägg till automatiserad bildanalys. För att göra det enklare att se alla embryon för varje villkor, en ImageJ Macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) skrevs, som monterar alla embryon från ett givet tillstånd till en enda TIFF-stack och matriser brightfield bilder och maximal intensitet projektion färg ( RGB) överlagringar, sida vid sida, för varje embryo. Metoderna validerades genom att använda dem för att karakterisera embryonal utveckling efter knock-down av 40 tidigare beskrivna utvecklingsgener i ett par specialbyggda stammar uttrycker fluorescerande markörer optimerad för att visualisera viktiga aspekter av köns skiktet specifikation och morfogenes10,11. Tillsammans kommer semi-High genomströmning embryo Imaging Protocol och verktyg bildbehandling möjliggör högre prov antal experiment och storskaliga screening insatser för att förstå utvecklingsprocesser. Dessutom, dessa stammar kommer också att ge ett effektivt sätt att undersöka effekterna av molekylära störningar på embryogenes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

C. elegans är det främsta systemet för systematisk analys av cellöde specifikation och morfogenetiska händelser under embryonal utveckling. En utmaning är att embryogenes dynamiskt utspelar sig under en period av ca 13 h; Denna halvdag långa tidsskalan har begränsat omfattningen av experiment genom att begränsa antalet embryon som kan avbildas. Här beskriver vi en semi-högt dataflöde protokoll som möjliggör samtidig 3D tidsförlopp avbildning av utvecklingen i 80 – 100 embryon vid måttlig tid upplösning, från upp till 14 olika förhållanden, i en enda övernattning. Protokollet är enkelt och kan implementeras av alla laboratorier med tillgång till ett Mikroskop med punkt besöks kapacitet. Nyttan av detta protokoll visas genom att använda den för att bilden två specialbyggda stammar uttrycker fluorescerande markörer optimerad för att visualisera viktiga aspekter av bakterie-skikt specifikation och morfogenes. För att analysera data, ett anpassat program som Beskär enskilda embryon ur ett bredare synfält i alla kanaler, z-steg, och tidpunkter och sparar sekvenser för varje embryo i en separat TIFF-stacken byggdes. Programmet, som innehåller ett användarvänligt grafiskt användargränssnitt (GUI), effektiviserar databehandling genom att isolera, förbehandling, och enhetligt orientera enskilda embryon som förberedelse för visualisering eller automatiserad analys. Levereras också är en ImageJ makro som sammanställer enskilda embryo data till en multi-panel fil som visar maximal intensitet fluorescens projektion och brightfield bilder för varje embryo vid varje tidpunkt. De protokoll och verktyg som beskrivs häri validerades genom att använda dem för att karakterisera embryonal utveckling efter knock-down av 40 tidigare beskrivna utvecklingsgener; denna analys visualiseras tidigare kommenterade utvecklingsmässiga fenotyper och avslöjade nya. Sammanfattnings, detta arbete Detaljer en semi-högt dataflöde Imaging metod tillsammans med ett beskärnings program och ImageJ visualiseringsverktyg som, när de kombineras med stammar som uttrycker informativa fluorescerande markörer, kraftigt accelererar experiment för att analysera embryonal utveckling.

En betydande utmaning i att karakterisera effekten av molekylära störningar på C. elegans embryonal utveckling är att det tar ca 10 h för embryon att utvecklas från första klyvning till slutet av tånet vid 20 °16. En metod med semi-högt dataflöde där stora kohorter av embryon kan avbildas samtidigt är användbart för händelser i denna tidsskala eftersom det medger avbildning av flera villkor parallellt med en tillräcklig Ensemble storlek för varje villkor för att möjlig...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Detta arbete beskriver ett semi-högt dataflöde protokoll som tillåter samtidig 3D Time-lapse Imaging av embryogenes i 80-100 C. elegans embryon i en enda över natten springa. Dessutom ingår verktyg för bildbehandling och visualisering för att effektivisera dataanalysen. Kombinationen av dessa metoder med anpassade reporter stammar möjliggör detaljerad övervakning av embryogenes.

Ett semi-högt dataflöde Imaging metod och data visualisering Toolkit för att analysera C. elegans embryonal utveckling

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

C.elegans embryogenesis tar ca 13 timmar, och övervakas vanligtvis genom att filma ett embryo i taget. Vårt protokoll, dock, tillåter samtidiga 3D-tid förfaller bildbehandling av 80 till 100 embryon. Förmågan att samla in data för ett stort antal utvecklande C.elegans-embryon öppnar upp för ett nytt spektrum av experiment, inklusive kvantitativ analys av utvecklingshändelser och storskaliga skärmar.Detta protokoll kan enkelt anpassas för att fånga olika utvecklingsprocesser eller till bildembryon som uttrycker någon kombination av markörer i vävnader av intresse. Det är utmanande att ordentligt sprida embryona i brunnarna. De bör vara nära varandra för att möjliggöra fångst av flera embryon per fält utan klumpar i olika Z-plan.Vi rekommenderar att du använder två forskare för sida vid sida dissekering, på is, och blockerar oanvända brunnar. Vi kommer också att visa några användbara knep för att snabbt inrätta en väl iscensatt 384-brunnsplatta. Börja med att täta en glasbottnad 384-brunnsplatta med PCR-självhäftande folie för att maskera oanvända brunnar.Använd en rakhyvel eller skalpell för att skära bort folien för att exponera en delmängd av brunnarna för användning. Tillsätt 70 mikroliter av nyberedd TMHC i varje brunn och håll plattan på is. Uteslut de yttre två raderna av plattan för att förhindra kanteffekter.För snabb provberedning rekommenderas sida vid sida dissekering av två forskare. När alla lösningen har pläterade, använd fin pincett och en dissekering mikroskop för att överföra cirka 10 gravid vuxna i 150 mikroliter iskall TMHC lösning inom en depression slide per villkor. Med hjälp av pincett och en skalpell, dissekera maskarna för att släppa embryon och ladda en drog kapillär pipett i en mun aspirator.Använd munpipetten för att överföra alla de två till åttacelliga steg embryon i enskilda brunnar av den beredda plattan och undersöka plattan för att bekräfta att inga aggregat finns inom några brunnar. När alla embryon har samlats in, sätt preparaten genom centrifugering och använd en etanoldränkt torka för att avlägsna eventuella rester från botten av plattan. Placera plattan i plattan innehavaren av en konfokalmikroskop utrustad med en temperaturkontrollerad miljö och använda 10X målet att utföra en pre-scan av varje brunn för att identifiera fält med lämpliga embryon.I slutet av skanningen, byta till 60X målet, justera fokalplanet vid varje punkt för att bilden ett till fyra fält per brunn och förvärva 18 Z-sektioner med två mikrometer intervall var 20 minuter i 10 timmar. När alla bilder har förvärvats, utföra en låg, hela väl brightfield scan, cirka 20 till 24 timmar efter starten av natten imaging att bedöma embryonala dödlighet. För automatiserad beskärning med hjälp av embryoCropUI körbar, först ladda ner programmet från Zenodo och testfilerna.zip för att avgöra om programmet fungerar som det ska på plattformen. När du har hämtat, packa upp och navigera för att hitta embryoCropUI körbar fil och dubbelklicka för att starta programmet. Välj öppen om du vill läsa in det första specifika 4D-synfältet för att beskära.När du beskär en TIFF-serie med flera dimensioner läses in endast den första bilden i serien inom mappen. När alla av bilderna har lästs in ange avbildningsparametrar, välj bakgrund subtraktion och dämpning korrigering, och ställa in bildsamlingsordningen och mikron per pixel. Välj sedan kör, en ny undermapp märkt gröda kommer att skapas i samma sökväg som uncropped mappen och de beskurna versionerna kommer att sparas på den här platsen.För visualisering, ladda ner den öppna och kombinerade MSV2 ImageJ plugin och grafiska användargränssnitt instruktioner Zenodorepov2. docx från Zenodo och öppna plugin i IMageJ. Leta upp linjerna tre och fyra och mata in den plats där bildmapparna ska lagras efter beskärningen.Bildmappens namn på de villkor som ska bearbetas, och den unika alfanumeriska identifieraren för varje experiment över natten. Klicka på kör när all information har angetts. Ett fönster kommer att visas som kommer att starta en uppmaning att navigera till den yttre mappen som innehåller de beskurna bildmapparna.När valt ett annat fönster kommer att visas som kommer att tillåta specifikation av avbildningsparametrar. Klicka på okej. Den sammansatta filen kommer att börja monteras.När den sammansatta har genererats granska de filer som lämnas öppna. När avbildas i samband anpassade reporter stammar ger informativa avläsningar för de flesta stora utvecklingshändelser. Inklusive sulfat specifikation, dorsala intercalation, epidermal kapsling, töjning och neurogenes.24 timmar efter injektion är en optimal tidpunkt för bildåtergivning. Från och med denna tid moderns protein utarmning och hämning av zygotic genuttryck är båda effektiva ger distinkta, mycket reproducerbara signatur fenotyper över ett brett spektrum av gener som deltar i sulfat specifikation och morfogenes. Det är viktigt att ha tålamod under dissektionen och embryots urvalssteg.Att minimera klumpandet och välja lämpliga fokalplan är också avgörande för att säkerställa data av hög kvalitet. Vårt protokoll kan utföras med en mängd olika fluorescerande markör stammar och i kombination med RNAi eller mutanter. Våra bearbetningsverktyg möjliggör strömlinjeformad, automatiserad eller manuell dataanalys.Med hjälp av de stammar, metoder och verktyg som beskrivs här vår grupp utfört en RNAi-baserade hög innehållsskärm inriktning cirka 2, 000 gener som krävs för embryonal utveckling. Halvhöga genomströmningsmetoder var nödvändiga för detta projekt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering av kondrocyttransplantation interkalering och riktnings spridning via Zebrabow Kloncellanalys i embryonala Meckels Brosk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom Profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Producerad Bovina Preimplantatorisk embryon med hjälp av två-färg microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

En mångsidig Monteringsmetod för Long Term avbildning av zebrafisk utveckling

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

En enkel metod för att identifiera kinaser som reglerar embryonisk stamcellspluripotens genom genomströmningshämmande screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flera Photon Time Lapse Imaging att visualisera utvecklingen i realtid: visualisering av migrera Neural Crest celler hos zebrafiskar embryon

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans att analysera intracellulära Transport i nervceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metod att studera utvecklingen av embryonala kyckling vävnader

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk Ljusplåt Mikroskopi och automatiserad cell Lineage analyser till katalogen Caenorhabditis elegans Embryogenesis med subcellulär upplösning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...