Name: a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development
Uploaded: 2019-10-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

S.D.O. Ulusal Institute of General Medical Sciences sponsorluğunda University of California San Diego Kurumsal Araştırma ve Akademik Kariyer Geliştirme Ödülü (NIH/IRACDA K12 GM068524) tarafından desteklendi. A.D. ve K.O. Ludwig Kanser Araştırmaları Enstitüsü tarafından desteklendi ve bu da onlara bu çalışmayı desteklemek için kullanılan araştırma fonu sağladı. Biz Andrew Chisholm bu projenin erken aşamalarında yaptığı tavsiye için müteşekkiriz, Ronald Biggs ilk yöntem geliştirme aşamasından sonra bu projeye katkıları için, ve Dave Jenkins ve Andy Shiau destek ve Küçük Molekül Discovery erişim için grubun yüksek içerikli görüntüleme sistemi.

1. C. elegans Embriyolarının Yarı-yüksek-yüksek-throughput Görüntüleme için hazırlanması
NOT: Protokolün bu bölümünün amacı, uygun marker suşlarından(Şekil 2)parçalanmış yarı senkronize (2 ila 8 hücreli evre) C. elegans embriyolarından oluşan bir popülasyonu görüntüleme için cam dipli 384 kuyulu bir plakaya yüklemektir. Diğer plaka biçimleri de işe yarayabilir, ancak küçük kuyu boyutu embriyol...

<ol>
	<li>Armenti, S. T., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherens+junctions+in+C.+elegans+embryonic+morphogenesis.">Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis.</a> Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+I:+development,+patterning,+and+growth.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).</li><li>Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-catenin-dependent+Wnt+signaling+in+C.+elegans:+teaching+an+old+dog+a+new+trick.">beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick.</a> Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).</li><li>Lamkin, E. R., Heiman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+morphogenesis+of+neurons+and+glia.">Coordinated morphogenesis of neurons and glia.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).</li><li>Loveless, T., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin+complexity:+recent+insights+into+cadherin+superfamily+function+in+C.+elegans.">Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , 1-16 (2005).</li><li>Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multipotency-to-commitment+transition+in+Caenorhabditis+elegans-implications+for+reprogramming+from+cells+to+organs.">The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs.</a> FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).</li><li>Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Embryonic+Morphogenesis.">elegans Embryonic Morphogenesis.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).</li><li>Wang, J. T., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+specification.">Germ cell specification.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+imaging+approach+to+profile+C.+elegans+embryonic+development.">A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development.</a> Development. 146 (7), (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dryad Digital Repository. , (2019).</li><li>Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zenodo. , (2018).</li><li>. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/renatkh/embryo_crop">https://github.com/renatkh/embryo_crop</a> (2018)</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Chisholm, A. D., Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+morphogenesis.">Epidermal morphogenesis.</a> WormBook. , 1-22 (2005).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+organization+during+foregut+development+mediated+by+the+organ+selector+gene+PHA-4/FoxA.">Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA.</a> PLoS Genetics. 6 (8), (2010).</li><li>Zhong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+binding+sites+defines+distinct+functions+for+Caenorhabditis+elegans+PHA-4/FOXA+in+development+and+environmental+response.">Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response.</a> PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).</li><li>Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+genes+identified+in+a+large-scale+RNAi+screen+using+the+RNAi-hypersensitive+Caenorhabditis+elegans+strain+nre-1(hd20)+lin-15b(hd126).">Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).</li><li>Canny, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+approach+to+edge+detection.">A computational approach to edge detection.</a> IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).</li><li>Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+milestones+punctuate+gene+expression+in+the+Caenorhabditis+embryo.">Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo.</a> Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).</li><li>Packer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage-resolved+molecular+atlas+of+C.+elegans+embryogenesis+at+single+cell+resolution.">A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Oegema, K., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division.">Cell division.</a> WormBook. , 1-40 (2006).</li><li>Insley, P., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+C.+elegans+embryo+alignments+reveal+brain+neuropil+position+invariance+despite+lax+cell+body+placement.">Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement.</a> PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).</li></ol>

Bu çalışma, C. elegansembriyonik gelişim genlerin işlevini profilini daha büyük ölçekli çabaları sağlamak için geliştirilen araçlar ve yöntemler bir paketi açıklanır. Yarı yüksek iş yöntemimiz, tek bir deneyde 80-100 embriyo için 20 dk çözünürlükte embriyonik gelişimin 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlar. Bu protokol istenilen herhangi bir belirteç suş (lar) ile kullanılmak üzere adapte edilebilir iken, bu çalışma embriyogenez sırasında olayları izlemek...

C. elegans embriyo mekanistik hücre biyolojisi ve hücre kader özellikleri ve morfogenetik olayların analizi için önemli bir model sistemi embriyonik gelişimsürüş 1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Bugüne kadar, embriyodaki hem hücresel düzeydeki olayların hem de hücre kaderi özelliklerinin karakterizasyonunun büyük bir kısmı, embriyoların her 10-100'de bir kez elde edilmesiyle göreceli olarak yüksek zamansal çözünürlük tesviye si kullanılarak elde edilmiştir. floresan belirteçler. Saniyeler ile on dakika arasında olan olaylar için çok uygun olsa da, bu yaklaşım teknik olarak daha uzun işlemlerin karakterizasyonu için, saat sırasına göre gün sınırlamaolur. Embriyonik gelişim ilk bölünmeden uzama sonuna kadar yaklaşık 10 saat sürer. Bu zaman ölçeğinde, farklı koşullardan daha büyük embriyo kohortlarının aynı anda daha düşük zaman çözünürlüğü görüntülemesini (yani, 5-20 dk zaman aralıklarında edinimi) sağlayacak yarı yüksek iş hacmi yöntemleri yeni bir deney yelpazesi ni açacak; örneğin, sistematik büyük ölçekli tarama çabalarının ve moleküler tedirginliklerin sonuçlarının karşılaştırılması için yeterli sayıda embriyonun analizini sağlamak.
Burada, 80-100 embriyoda, 14 farklı koşullarda, tek bir gecede gelişimin eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlayan C. elegans embriyogenezi izlemek için yarı-yüksek iş lenme yöntemini tanımlıyoruz. Protokolün uygulanması kolaydır ve nokta ziyaret yeteneklerine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından gerçekleştirilebilir. Bu protokoldeki önemli adımlar Şekil 1'deözetlenmiştir. Kısacası, embriyolar ilgi floresan belirteçleri ifade gravid yetişkin ve görüntüleme için 384-well plaka kuyuları genç embriyolar (2-8 hücre evresi) transfer kesilir. Bu formatta, nispeten küçük ve iyi boyutlu huniler embriyoları dar bir alana aktararak, zaman atlamalı görüntüleme için birden fazla embriyo içeren alanların belirlenmesini kolaylaştırır. Embriyo kohort genelinde kabaca senkron gelişimi korumak için, diseksiyonlar soğutulmuş ortamda yapılır ve plaka buz üzerinde tutulur, hangi bir saat süren diseksiyon süresi sırasında önemli gelişmeyi önler. Plaka mikroskoba aktarılır ve embriyolar 2 μm adımlarda tam z aralığı toplamak için, 60x yağ daldırma 1.35 NA lens kullanılarak, 20 dakika zaman aralıkları, bir gecede sıcaklık kontrollü bir odada filme alınır. Her biri 1-5 embriyo içeren elli alan, tek bir gecede görüntülenir. İstenilen deneye bağlı olarak, görüntülenmiş alanların sayısını orantılı olarak azaltarak zaman çözünürlüğü (örneğin, 5-10 dk aralıklarla görüntüleme) artırılabilir.
Bu protokolle, tek bir gecede bile önemli miktarda veri (50 alana yayılmış 80-100 embriyo) üretir ve daha büyük deneyler veri analizi açısından hızla yönetilemez hale gelebilir. Bu verilerin işlenmesini, görselleştirilmesini ve çözümlenmesini kolaylaştırmak için, embriyoları kırpmak ve yönlendirmek ve ön işleme adımlarını (isteğe bağlı) gerçekleştirmek için bir program ve görüntülemeyi kolaylaştırmak için verileri derleyen bir ImageJ makrosu oluşturulmuştür. Bu programlar, yalnızca tek bir parlak alan düzlemi gerektiren görüntüleme yönteminden bağımsız olduklarından, geleneksel yaklaşımlar kullanılarak toplanan görüntüleri işlemek için kullanılabilir. İlk program birden fazla embriyo içeren bir 4D alan alır (GUI seçeneği veya kaynak kodu embryoCrop.py) veya birden fazla embriyo içeren birden fazla 4D alanları (screenCrop.py), sıkıca embriyolar bitkileri ve ön-posterior yapılandırma onları yönlendirir. Bu programlar ayrıca kullanıcılara arka plan çıkarma, sürüklenme düzeltme ve zayıflatma düzeltmesi yapma seçeneği de verir. Elde edilen dosyalar, otomatik görüntü analizi için değiştirilebilir her embriyo için düzgün bir şekilde önceden işlenmiş, sıkıca kırpılmış tiff yığınlarıdır. Her durum için tüm embriyoları görüntülemeyi kolaylaştırmak için, belirli bir durumdan tüm embriyoları tek bir tiff yığınına ve diziparlak görüntülere ve maksimum yoğunluklu projeksiyon rengine monte eden bir ImageJ makrosu (OpenandCombine_embsV2.ijm) yazıldı. RGB) her embriyo için yan yana bindirmeler. Yöntemler, mikrop tabakasının önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden özel olarak üretilmiş bir çift suşta daha önce tanımlanmış 40 gelişimgenin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulandı. özellikleri ve morfogenez10,11. Birlikte, yarı-yüksek iş letme embriyo görüntüleme protokolü ve görüntü işleme araçları daha yüksek örnek numarası deneyleri ve gelişimsel süreçleri anlamaya yönelik büyük ölçekli tarama çabaları sağlayacaktır. Buna ek olarak, bu suşlar da embriyogenez üzerinde moleküler pertürbations etkilerini incelemek için etkili bir araç sağlayacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1086">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Aspirator Tube Assembly</td>
			<td style="width:225px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:491px;">2-000-000</td>
			<td style="width:85px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated Pipette (25mL)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>2-000-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Voyager Software</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>Included with CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical Tube (15 mL )</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CV1000 Microscope</td>
			<td>Yokogawa Electric Corp</td>
			<td>CV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depression slide (3-well)</td>
			<td>Erie Scientific</td>
			<td>1520-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5811 07336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open Source</td>
			<td>https://imagej.net/Fiji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M9 Buffer</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>https://openwetware.org/wiki/M9_salts</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tube (1.5 mLl)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microseal F-foil Seal</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MSF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGM Plates</td>
			<td>Lab Prepared</td>
			<td>http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel #15</td>
			<td>Bard Parker</td>
			<td>REF 371615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>781855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetramisole Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldirch</td>
			<td>T1512-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tweezers, Dumont #3</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>0109-3-PO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (10&#215; 0.4NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-PlanApo objective (60&#215; 1.35 NA)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semi-high-throughput imaging method and data visualization toolkit to analyze c. elegans embryonic development

C. elegans, embriyonik gelişim sırasında hücre kader özelliklerinin ve morfogenetik olayların sistematik analizinde önde gelen sistemdir. Bir sorun embriyogenez dinamik yaklaşık 13 saat bir süre içinde gelişir; bu yarım günlük zaman ölçeği, görüntülenebilen embriyo sayısını sınırlayarak deneylerin kapsamını kısıtlamıştır. Burada, orta zaman çözünürlükte 80-100 embriyoda, 14 farklı koşuldan, tek bir gecede, aynı anda 3D hızlandırılmış gelişim görüntülemesağlayan yarı-yüksek iş letme protokolü açıklıyoruz. Protokol basittir ve nokta ziyaret kapasitesine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından uygulanabilir. Bu protokolün yararı, mikrop tabakası belirtimi ve morfogenezin önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden iki özel olarak üretilmiş suşları görüntülemek için kullanılarak gösterilmiştir. Verileri analiz etmek için, tüm kanallarda, z adımlarında ve zaman noktalarında tek tek embriyoları daha geniş bir görüş alanından eken ve her embriyo için dizileri ayrı bir tiff yığınına kaydeden özel bir program oluşturulmuştür. Kullanıcı dostu bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içeren program, görselleştirme veya otomatik analize hazırlık olarak bireysel embriyoları izole ederek, ön işlemeye ve tek tip yönlendirerek veri işlemeyi kolaylaştırır. Ayrıca her zaman noktasında her embriyo için maksimum yoğunlukfloresan projeksiyon ve brightfield görüntüleri görüntüleyen bir çok panelli dosya içine bireysel embriyo verileri derleyen bir ImageJ makro. Burada açıklanan protokoller ve araçlar, daha önce tanımlanmış 40 gelişimsel genin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulanmıştır; bu analiz daha önce açıklamalı gelişimsel fenotipleri görselleştirmiş ve yenilerini ortaya koymuştur. Özetle, bu çalışma ayrıntıları bir kırpma programı ve ImageJ görselleştirme aracı ile birleştiğinde bir yarı-yüksek-throughput görüntüleme yöntemi, bilgilendirici floresan belirteçleri ifade suşları ile birleştiğinde, büyük ölçüde analiz etmek için deneyler hızlandırır embriyonik gelişim.

Moleküler tedirginliklerin C. elegans embriyonik gelişimi üzerindeki etkisini karakterize etmede önemli bir zorluk, embriyoların ilk bölünmeden 20°16'dauzama nın sonuna kadar ilerlemesi için yaklaşık 10 saat almasıdır. Büyük embriyo kohortlarının aynı anda görüntülenebileceği yarı yüksek iş yapma yöntemi, bu zaman ölçeğindeki olaylar için yararlıdır, çünkü her koşul için yeterli topluluk boyutuna paralel olarak birden fazla koşulun görüntülenmesin...

Watch this Scientific Journal Video about A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development at JoVE.com

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

C.elegans embriyogenez yaklaşık 13 saat sürer ve genellikle bir seferde bir embriyo filme tarafından izlenir. Ancak protokolümüz, 80-100 embriyonun eşzamanlı 3Boyutlu zaman atlamalı görüntülemesine olanak sağlıyor. Gelişmekte olan c.elegans embriyolarının çok sayıda için veri toplama yeteneği, gelişimsel olayların ve büyük ölçekli ekranların nicel analizi de dahil olmak üzere yeni bir deney yelpazesini ortaya çıkar.Bu protokol, farklı gelişimsel süreçleri yakalamak veya ilgi dokularında belirteçlerin herhangi bir kombinasyonunu ifade eden görüntü embriyolarına kolayca uyarlanabilir. Embriyoları kuyuların içine düzgün bir şekilde dağıtmak zordur. Farklı Z düzlemlerinde kümelenmeden alan başına birden fazla embriyonun yakalanmasını sağlamak için birbirine yakın olmalıdırlar.Yan yana diseksiyon, buz üzerinde iki araştırmacı kullanmanızı ve kullanılmayan kuyuları engellemenizi öneririz. Biz de hızlı bir şekilde iyi hazırlanmış 384-iyi plaka kurmak için bazı yararlı hileler gösterecektir. Kullanılmayan kuyuları maskelemek için PCR yapışkan folyo ile cam dipli 384 kuyulu bir plakayı mühürleyerek başlayın.Kullanım için kuyuların bir alt kümesini ortaya çıkarmak için folyoyu kesmek için jilet veya neşter kullanın. Her kuyuya 70 mikrolitre taze hazırlanmış TMHC ekleyin ve plakayı buzüzerinde tutun. Kenar efektlerini önlemek için plakanın dış iki satırını hariç tonuyla.Hızlı numune hazırlama için iki araştırmacı tarafından yan yana diseksiyon önerilir. Çözeltinin tamamı kaplandığında, her koşulda bir depresyon slaytı içinde yaklaşık 10 gravid yetişkini 150 mikrolitre buz gibi TMHC çözeltisine aktarmak için ince cımbız ve diseksiyon mikroskobu kullanın. Cımbız ve neşter kullanarak, embriyoları serbest bırakmak ve bir ağız aspiratör içine çekilen bir kılcal pipet yüklemek için solucanlar incelemek.İki ila sekiz hücreli evre embriyoların tümünün hazırlanan plakanın ayrı kuyularına aktarılması için ağız pipetini kullanın ve herhangi bir kuyuda agrega bulunmadığını doğrulamak için plakayı inceleyin. Tüm embriyolar toplandığında, santrifüj ile örnekleri yerleştirin ve plakanın alt kısmından herhangi bir kalıntı kaldırmak için bir etanol ıslatılmış mendil kullanın. Plakayı sıcaklık kontrollü bir ortamla donatılmış bir konfokal mikroskobun plaka tutucusuna yerleştirin ve uygun embriyolara sahip alanları belirlemek için her kuyunun ön tayinini yapmak için 10X hedefini kullanın.Tarayın sonunda, 60X hedefine geçin, her noktada odak düzlemini her kuyuda bir ila dört alana göre ayarlayın ve 10 saat boyunca her 20 dakikada bir iki mikrometre aralıklarla 18 Z-kesit elde edin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, embriyonik öldürücülüğü değerlendirmek için gece görüntülemenin başlamasından yaklaşık 20 ila 24 saat sonra, düşük, bütün parlak alan taraması yapın. embriyoCropUI çalıştırılabilir kullanarak otomatik kırpma için, ilk Zenodo ve test dosyaları programı indirin.zip programın platformda düzgün çalışıp çalışmadığını belirlemek için. Bir kez indirilen, unzip ve embriyoCropUI yürütülebilir dosyabulmak için gidin ve programı başlatmak için çift tıklayın. Kırpmak için ilk özel 4B görüş alanını yüklemek için açık'ı seçin.Birden fazla boyutlu bir TIFF serisini kırpma yaparken, yalnızca klasör içindeki serideki ilk görüntüyü yükleyin. Tüm görüntüler yüklendiğinde görüntüleme parametrelerini belirtin, arka plan çıkarma ve zayıflatma düzeltmesini seçin ve görüntü toplama sırasını ve piksel başına mikronları ayarlayın. Ardından çalıştır'ı seçin, kırpılmamış klasörle aynı yolda yeni bir alt klasör etiketlenir ve kırpılan sürümler bu konuma kaydedilir.Görselleştirme için, açık ve birleşik MSV2 ImageJ eklentisi ve grafik kullanıcı arabirimi talimatları Zenodorepov2 indirin. Zenodo docx ve IMageJ eklentisi açın. Üç ve dördüncü satırları bulun ve kırpmadan sonra resim klasörlerinin depolanacak konumu girdi.İşlenecek koşulların görüntü klasörü adları ve her gecelik deneme için benzersiz alfasayısal tanımlayıcı. Tüm bilgiler girildiğinde çalıştır'ı tıklatın. Kırpılan resim klasörlerini içeren dış klasöre gitmek için bir istem başlatacak bir pencere görüntülenir.Seçildikten sonra görüntüleme parametrelerinin belirtimine izin verecek başka bir pencere görüntülenir. Tamam'ı tıklatın. Bileşik dosya biraraya başlayacaktır.Bileşik oluşturulduğunda, açık bırakılan dosyaları gözden geçirin. Birlikte görüntülendiğinde özel muhabir suşları en büyük gelişimsel olaylar için bilgilendirici okumalar sağlar. Sülfat belirtimi dahil, dorsal intercalation, epidermal muhafaza, uzama, ve nörogenez.Enjeksiyondan 24 saat sonra görüntüleme için en uygun zaman noktasıdır. Bu süre itibariyle maternal protein tükenmesi ve zigotik gen ekspresyonunun inhibisyonu, sülfat belirtimi ve morfogenezde yer alan genlerin geniş bir spektrumu nda farklı, yüksek oranda tekrarlanabilir imza fenotipleri veren etkilidir. Diseksiyon ve embriyo seçimi adımları sırasında sabırlı olmak önemlidir.Kümelenmeyi en aza indirmek ve uygun odak düzlemlerini seçmek de yüksek kaliteli veri sağlamak için gereklidir. Protokolümüz çeşitli floresan marker suşları ile ve RNAi veya mutantlar ile birlikte yapılabilir. İşleme araçlarımız, kolaylaştırılmış, otomatik leştirilmiş veya manuel veri analizine olanak sağlar.Burada açıklanan suşları, yöntemleri ve araçları kullanarak grubumuz embriyonik gelişim için gerekli olan yaklaşık 2.000 geni hedefleyen RNAi tabanlı yüksek içerikli bir ekran gerçekleştirdi. Bu proje için yarı-yüksek iş metotları gerekliydi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embriyonik Kök Hücre Pluripotansını Yüksek Verimli İnhibitör Taramayla Düzenleyen Kinazları Tanımlamak İçin Basit Bir Yöntem

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans nöron hücre içi taşıma analiz immobilizasyon

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...