Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

ونحن ممتنون لدعم جامعه كاليفورنيا في سان دييغو Moores مركز السرطان الحيوي والانسجه الموارد المشتركة التكنولوجيا ، وأعضاء مختبر Lowy ، وجامعه كاليفورنيا في سان دييغو قسم الجراحة ، قسم الأورام الجراحية. ويدعم AML بسخاء من قبل المعاهد القومية للصحة CA155620, SU2C CRUK Lustgarten مؤسسه السرطان البنكرياس جائزه فريق الحلم (SU2C-20-16), والجهات المانحة للصندوق لعلاج سرطان البنكرياس.

تم استعراض جميع جمع الانسجه البشرية لاستخدام البحوث والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة الداخلية لدينا. يتم تنفيذ جميع البروتوكولات التالية في ظل ظروف عقيمه في بيئة مختبر ثقافة الثدييات الانسجه.
1. اعداد وسائل الاعلام
<ol><li>اعداد وسائل الاعلام المكيفة. ملاحظه: تتطلب وسائ...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

هنا ، نقدم البروتوكولات الحالية لعزل وتوسيع وتوصيف العضوي PDAC المشتقة من المريض. لدينا معدل النجاح الحالي لإنشاء ثقافة organoid هو أكثر من 70 ٪. التالي ، فان هذه الأساليب لم تكتمل بعد ومن المتوقع ان تتحسن وتتطور مع مرور الوقت. وينبغي إيلاء الاعتبار الهام لحجم العينة ، حيث ان PDAC لديه شريط سينمائي ?...

سرطان الغدد السرطانية في البنكرياس (PDAC) هو مرض مميت يتميز بالتشخيص المتاخر في معظم المرضي ، ونقص العلاجات الفعالة ، وما ينجم عنه من انخفاض معدل البقاء الكلي لمده 5 سنوات والذي لا يزال اقل من 10%1. يتم تشخيص 20 ٪ فقط من المرضي مع مرض موضعي مناسبه للتدخل الجراحي العلاجي2،3. وعاده ما يتم التعامل مع المرضي المتبقيين مع مزيج من عوامل العلاج الكيميائي التي تكون فعاله في اقليه من المرضي4,5. لتلبيه هذه الاحتياجات السريرية الملحة ، يعمل الباحثون بنشاط علي استراتيجيات الكشف المبكر وتطوير علاجات أكثر فعاليه. لتسريع الترجمة السريرية من الاكتشافات الهامه ، والعلماء يستخدمون نماذج الماوس المهندسة وراثيا ، المريض المستمدة xenografts ، خطوط الخلايا أحاديه الطبقة ، و ، في الاونه الاخيره ، نماذج organoid6.
الثقافة العضوية الظهاريه ثلاثية الابعاد باستخدام عامل النمو و Wnt-ligand الظروف الغنية لتحفيز انتشار الخلايا السلف غير المتحولة ووصفت لأول مره للأمعاء الفئران7 وتم تكييفها بسرعة لأنسجه البنكرياس البشرية العادية8. بالاضافه إلى الانسجه الانبوبيه العادية ، ومنهجيه organoid يسمح للعزل ، والتوسع ، ودراسة PDAC الإنسان8. الأهم من ذلك ، فان الطريقة تدعم إنشاء organoids من العينات الجراحية ، فضلا عن الخزعات الدقيقة والاساسيه ابره ، مما يسمح للباحثين لدراسة جميع مراحل المرض9،10. ومن المثير للاهتمام ان العضوية المشتقة من المريض تلخص الأنواع الفرعية الموصوفة جيدا للورم وقد تمكن من تطوير منصات الطب الدقيقة9,11.
البروتوكولات العضوية الحالية ل PDAC تمكين التوسع الناجح لأكثر من 70 ٪ من عينات المريض من العلاج الكيميائي الساذج المرضي9. هنا نقدم الأساليب القياسية المستخدمة من قبل المختبر لدينا لعزل ، وتوسيع ، وتوصيف المستمدة من المريض العضوي PDAC. وقد وصفت منهجيات organoid أخرى pdac12،13 ولكن لم يتم اجراء مقارنه لهذه الطريقة بدقه. وبما ان هذه التكنولوجيا جديده نسبيا وتتقدم بسرعة ، فاننا نتوقع ان تستمر هذه البروتوكولات في التطور والتحسن ؛ ومع ذلك فان مبادئ التعامل مع الانسجه والثقافة العضوية ستظل مفيده.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

سرطان الغدد السرطانية في البنكرياس (PDAC) هو من بين الأورام الخبيثة الأكثر فتكا. في الاونه الاخيره ، تم وصف الجيل التالي من أساليب الثقافة العضوية التي تمكن من النمذجة ثلاثية الابعاد (3D) لهذا المرض. ويمكن عزل نماذج العضو العضوي المشتقة من المريض من كل من العينات الجراحية وكذلك الخزعات الصغيرة والشكل السريع في الثقافة. والاهم من ذلك ، تحافظ النماذج العضوية علي التعديلات الوراثية المسببة للامراض المكتشفة في ورم المريض وهي تنبئي باستجابة المريض للعلاج ، التالي تمكين الدراسات الانتقالية. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولات شامله للتكيف الانسجه ثقافة سير العمل لدراسة 3D ، مصفوفة مضمنه ، نماذج organoid. نحن التفاصيل الطرق والاعتبارات لعزل ونشر الاساسيه PDAC العضوي. وعلاوة علي ذلك ، فاننا نوضح كيف يتم اعداد وسائل الاعلام العضوية مفصل والجودة التي تسيطر عليها في المختبر. وأخيرا ، فاننا وصف الاختبارات لتوصيف المصب من النماذج العضوية مثل عزل الأحماض النووية (DNA و RNA) ، واختبار المخدرات. ومن المهم ان نقدم الاعتبارات الحاسمة لتنفيذ منهجيه organoid في مختبر البحوث.

لتوضيح التحديات المرتبطة بعزل العضو العضوي من PDAC ، فاننا نظهر إنشاء الثقافة العضوية المشتقة من المريض من عينه ورم هيبوسيلولار صغيره. بعد الطلاء الاولي ، فقط عدد قليل من العضوية كانت مرئية في البئر ، كما هو مبين في الشكل 1. وسمح للعضويين بالنمو بشكل أكبر علي مدي أسبوعين وكان?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

الثقافات العضوية المستمدة من المريض من سرطانات الغدة السرطانية الاقنيه البنكرياس هي نموذج بسرعة 3-الابعاد التي تمثل المقصورات الخلايا الظهاريه الورم مع الإخلاص عاليه, تمكين البحوث متعديه في هذا الخبيثة القاتلة. هنا ، ونحن نقدم أساليب مفصله لإنشاء ونشر العضوية وكذلك لاجراء الاختبارات البيولوجية ذات الصلة باستخدام هذه النماذج.

العزلة وتوصيف المرضي المستمدة من البنكرياس اقنيه الغدد السرطانية الأورام العضوية

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

هذه الطريقة مهمة لأن النماذج العضوية المستمدة من المريض هي أداة قوية وسريعة لدراسة سرطان البنكرياس لأنها تعكس عدم التجانس الجيني والذهني لهذا المرض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن organoids يمكن عزلها مع معدل نجاح عال من كمية محدودة من السرطان ويمكن توسيعها بسرعة في المختبر لتحليل المصب. دراسة العضيات'استجابة للأدوية السامة للخلايا قد تساعدنا على فهم لماذا تصبح الأورام مقاومة للعلاج وتحديد استراتيجيات العلاج أكثر فعالية.لبدء هذا الإجراء، استرداد لوحة 12-جيدا المعدة من الحاضنة. مع رافع خلية معقمة، رفع بلطف قبة استخراج غشاء الطابق السفلي بحيث يتم العائمة في وسائل الإعلام كاملة مع التأكد من تجنب كشط الجزء السفلي من البئر. باستخدام ماصة P1000، قم بنقل قبة BME والوسائط بعناية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.كرر هذه الخطوة لكل إضافة تحتوي على الجهاز. غسل بلطف كل بئر التي تم حصادها مع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام القاعدية الباردة ونقل هذا الغسيل إلى أنبوب يحتوي على organoids. خلط شامل الحل والأعضاء مع ماصة P1000 وتدور في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.طبقة من BME تحتوي على organoids في التعليق وبيليه organoid سوف تظهر في الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة بعناية فائقة التأكد من تجنب أي خسارة من طبقة BME وعضوي. ضع الأنبوب على الجليد.إضافة 10 ملليلتر من الجليد محلول استرداد الخلايا الباردة إلى الأنبوب ومزيج دقيق من قبل الانقلاب. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في حين خلط كل ثلاث دقائق عن طريق عكس. بعد هذا، الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.يجب أن تكون بيليه الجهازية واضحة في حين أن طبقة BME يجب أن تختفي. إذا انخفضت طبقة BME في الحجم ولكنها لا تزال مرئية، احتضان لمدة 30 دقيقة إضافية في أربع درجات مئوية وتكرار الطرد المركزي. مرة واحدة وقد تم depolymerized BME، وإزالة حل استرداد الخلية في حين ترك وراءه بيليه organoid.غسل organoids مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام القاعدية عن طريق الاختلاط مع انقلاب. الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق، وإزالة ناظر، ووضع أنبوب مع بيليه organoid على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل. اختياريا، إذا كان المطلوب إعداد خلية واحدة، إضافة ثلاثة ملليلتر من التربسين تكملها 30 ميكرولترات من DNAse الأول الحل إلى organoids.احتضان هذا التفاعل الأنزيمي في 37 درجة مئوية مع انعكاس لطيف خلط كل دقيقتين لمدة تصل إلى 10 دقائق. استخدام المجهر برايتفيلد لمراقبة وتأكيد أن تفكك خلية واحدة ناجحة. لوقف التفاعل الأنزيمي، إضافة 10 ملليلتر من الجليد الباردة وسائط القاعدية وتدور في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.ثم إزالة ناظر. اغسل الخلايا بـ 10 ملليلترات من الوسائط القاعدية عن طريق الاختلاط مع الانعكاس اللطيف. مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 200 مرة ز لمدة خمس دقائق.إزالة فائقة وتكرار هذه عملية غسل وrifuging مرة أخرى. ضع الأنبوب مع بيليه الخلية على الجليد لمدة خمس دقائق على الأقل. بعد ذلك، إضافة الجليد البارد BME إلى بيليه الخلية واستخدام ماصة P200 لخلط الحل بلطف حتى يكون متجانسا.ثم ضع طرف الماصة بالقرب من الجزء السفلي من الأنبوب والماصة صعودا وهبوطا ما لا يقل عن خمس إلى 10 مرات لتفريق ميكانيكيا organoids. استخدام ماصة P200 لبقعة قبة 100 ميكرولتر في وسط بئر من قبل تسخين 12 جيدا لوحة. كرر حتى يتم الاستغناء عن كل من حل BME.ثم نقل بعناية لوحة إلى حاضنة في 37 درجة مئوية للسماح هلام BME لترسيخ. بعد 10 دقائق، واسترداد لوحة وإضافة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام العضوية كاملة قبل الدافئة إلى كل بئر. وعادة ما يتم تمرير الثقافات العضوية على مدى سبعة إلى 10 أيام اعتمادا على كثافة الثقافة والانتشار.إذا لزم الأمر، قم بزيادة الثقافات مع 200 ميكرولترات من وسائل الإعلام العضوية الدافئة مسبقاً كل خمسة أيام للتعويض عن استنفاد عامل النمو والتبخر. بعد عزل الخلايا الفردية من الأعضاء ، resuspend الخلايا المفردة في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الكاملة العضوية البشرية. بعد ذلك، استخدم عداد خلية تلقائية لحساب الخلايا مع التأكد من تسجيل صلاحية الخلية.حساب العدد الإجمالي للخلايا والخلايا القابلة للحياة الموجودة في تعليق ميليلتر واحد. ثم إزالة حجم يعادل 400،000 الخلايا ونقلها إلى أنبوب جديد. إضافة وسائل الاعلام العضوية كاملة لهذا الأنبوب لتحقيق حجم يصل إلى 7.2 ملليلتر.للاختبار العلاجي، قم بإعداد الخلايا للطلاء عن طريق خلط 800 ميكرولتر من BME مع 7.2 ملليلتر من الوسائط الكاملة العضوية التي تحتوي على الخلايا على الجليد. نقل الخليط إلى خزان الاحتفاظ على الجليد واستخدام ماصة 12 قناة لصفيح 20 ميكرولترات من هذا الخليط في كل بئر من لوحة 384 جيدا مما أدى إلى ما يقرب من 1،000 الخلايا يجري مطلية في بئر. ثم تدور أسفل لوحة في 100 مرة ز لمدة دقيقة واحدة في دلو أرجوحة ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الأنسجة في 37 درجة مئوية.بعد 24 ساعة، استخدم مجهر برايتفيلد للتحقق من وجود الأجهزة. في هذه الدراسة ، يتم عزل الجهاز العضوي PDAC المشتق من المريض وتوسيعه وتميزه. لتوضيح التحديات المرتبطة بعزل الأعضاء من PDAC ، يتم تأسيس ثقافة أعضاءية تمثيلية مشتقة من المريض من عينة ورم ناقص الخلية صغيرة.ويسمح organoids أن تنمو أكبر على مدى أسبوعين ويتم تمريرها وفقا للبروتوكول لإنشاء ثقافة أكثر قوة. خلايا واحدة من المنشأة وسريعة النمو ممثل PDAC organoid ثم يتم إعدادها لإثبات نتيجة بروتوكول pharmacotyping. 1,000 يتم مطلي الخلايا القابلة للحياة في كل بئر ويسمح للتعافي على مدى فترة 24 ساعة قبل أن يتم حقن وكلاء العلاج الكيميائي السام للخلايا.يتم إجراء فحص الجرعة 9.0 في ثلاثية كريات بدءا من جرعة منخفضة من 100 picomolar وتنتهي مع جرعة عالية من اثنين من micromolar. بعد العلاج لمدة خمسة أيام، يتم التقاط صور تمثيلية للآبار المعالجة بالمركبة وبجرعة عالية من كل عامل كيميائي. مباشرة بعد التقاط الصور، يتم تقييم صلاحية الخلية باستخدام كاشف قابلية الخلية للإنارة وتآمر باستخدام برنامج الرسوم البيانية.يمكن أن يكون الأعضاء المشتقة من المريض لديها مورفولولوجيا غير متجانسة. لذلك، من المهم تحسين حالات الانفصال الأنزيمية لكل ثقافة واحدة. عادةً ما ينطوي تحليل الزّقوط للنماذج المشتقة من المريض على تسلسل الجيل التالي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي.إذا كان ذلك ممكنا، والتحقق من صحة الخصائص الجزيئية للنماذج باستخدام عينات الأنسجة الأولية. الثقافات العضوية الفردية تفتح إمكانية للنهج الطب الشخصية لمرضى سرطان البنكرياس. تذكر أن المواد الكيميائية الخطرة مثل الفينول الكلوروفورم والعوامل الكيميائية يجب التعامل معها مع معدات الحماية الشخصية المناسبة والسلامة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

الموجات فوق الصوتية غرس العظام البنكرياس الاقنيه اللحمية

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

عزل السوائل القريبة للتحقيق في البيئة الدقيقة للورم من سرطان البنكرياس الغدي

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

إنشاء واستخدام نماذج الطعم الخارجي المشتقة من المريض لورم خبيث في الجهاز العصبي المركزي

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

إنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من مريض الزرد من سرطان البنكرياس لاختبار الحساسية الكيميائية

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...