Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

我们感谢加州大学圣地亚哥摩尔斯癌症中心生物储存和组织技术共享资源，洛伊实验室的成员，以及加州大学圣地亚哥外科部，外科肿瘤科的支持。AML 得到 NIH CA155620、SU2C CRUK 卢斯特加滕基金会胰腺癌梦团队奖（SU2C-AACR-DT-20-16）的慷慨支持，以及治疗胰腺癌基金的捐赠者。

所有用于研究的人体组织收集都经过内部审查委员会 （IRB） 的审查和批准。在哺乳动物组织培养实验室环境中，以下所有协议均在无菌条件下执行。
1. 媒体准备
<ol><li>有条件的介质准备。 注：人体胰腺有机体培养物需要丰富的生长因子和营养，以及条件性介质补充，为器官扩张提供足够的生长刺激。下面描述的两种条件介质都是从市售的细胞系制备的（见材料表<...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

在这里，我们提出用于隔离、扩展和描述患者衍生的PDAC有机体的当前方案。目前，我国建立有机体栽培的成功率超过70%;因此，这些方法尚未完善，并有望随着时间的推移而改进和发展。应重视样本大小，因为PDAC具有低肿瘤细胞性。因此，小标本将包含很少的肿瘤细胞，并且只会产生少量的有机物。此外，许多患者在手术干预15之前接受化疗和/或化疗为基础的新辅助治疗。如果?...

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命的疾病，大多数患者诊断较晚，缺乏有效的治疗方法，导致5年总存活率较低，仍然低于10%1。只有20%的患者被诊断为局部疾病，适合治疗手术干预2，3。其余患者通常使用化疗剂的组合进行治疗，这些药物对少数患者有效4，5。为了满足这些紧迫的临床需求，研究人员正在积极研究早期发现策略和开发更有效的疗法。为了加速重要发现的临床翻译，科学家们正在采用基因工程小鼠模型、患者衍生异种移植物、单层细胞系，以及最近6个有机体模型。
利用生长因子和Wnt-ligand丰富条件刺激未转化祖细胞增殖的三维上皮有机体培养首先为小鼠肠道7进行了描述，并很快适应了正常的人类胰腺组织8。除了正常的导管组织，有机体方法允许分离，扩大和研究人类PDAC8。重要的是，该方法支持建立从手术标本，以及精细和核心针活检，使研究人员研究疾病的所有阶段9，10。有趣的是，患者衍生的有机物重述了描述良好的肿瘤转录组子型，并可能支持开发精密医学平台9，11。
目前PDAC的有机体方案使超过70%的患者样本成功地从化疗患者9中扩展。在这里，我们介绍了我们的实验室用于分离、扩展和表征患者衍生的PDAC有机体的标准方法。其他PDAC有机体方法已被描述12，13，但没有对这些方法进行比较。由于这项技术相对较新且发展迅速，我们预计这些协议将继续改进和改进;然而，组织处理和有机体培养的原则将继续有用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的恶性肿瘤之一。最近，介绍了支持该疾病的三维（3D）建模的下一代有机体培养方法。患者衍生的有机体 （PDO） 模型可以从手术标本和小活检中分离出来，并在培养中快速形成。重要的是，有机体模型保存了在患者肿瘤中检测到的致病基因改变，并预测患者的治疗反应，从而支持转化研究。在这里，我们提供用于调整组织培养工作流程以研究3D、基体嵌入式、有机体模型的全面协议。我们详细介绍了隔离和传播初级 PDAC 有机体的方法和注意事项。此外，我们描述了在实验室中如何制备定制有机物介质并控制质量。最后，我们描述了有机体模型的下游表征的测定方法，如核酸分离（DNA和RNA）和药物测试。重要的是，我们为在研究实验室中实施有机体方法提供了重要的考虑因素。

为了说明与从PDAC分离有机体相关的挑战，我们展示了从小低细胞肿瘤样本中建立患者衍生的有机体培养物。初始电镀后，每口井只可以看到几个有机物，如图1所示。有机体被允许在2周内变大，并根据我们的协议通过，以建立一个更强大的文化，如早期和后期段落1代表性图片（图1）。需要注意的是，在晚期原体分离物中观察到的较大的囊性有机体在?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

胰腺导管腺癌患者衍生的有机体培养是一种快速建立的三维模型，代表高保真度的上皮肿瘤细胞室，从而能够对这种致命的恶性肿瘤进行转化研究。在这里，我们提供详细的方法来建立和传播有机体，以及使用这些模型执行相关的生物测定。

患者衍生胰腺腺腺腺腺癌有机体模型的分离和特征

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

这种方法意义重大，因为患者衍生的器官模型是研究胰腺癌的有力和快速工具，因为它们反映了这种疾病的遗传和表型异质性。这种技术的主要优点是，器官可以与有限的癌症的高成功率分离，他们可以迅速扩大体外下游分析。研究器官对细胞毒性药物的反应可能有助于我们理解肿瘤为什么对治疗产生抗药性，并定义更有效的治疗策略。要开始此过程，请从培养箱中取回准备好的 12 井板。使用无菌电池升降机，轻轻抬起地下室膜提取物圆顶，使其漂浮在完整的介质中，同时确保避免刮孔底部。使用 P1000 移液器，小心地将 BME 圆顶和介质转移到 15 毫升锥形管中。对每个含器官井重复此步骤。用一毫升的冷基底介质轻轻清洗收获的每一个井，然后将这种洗涤转移到含有有机体管的管中。将溶液和有机体与 P1000 移液器彻底混合，以 200 次 g 旋转，5 分钟。一层含有悬浮器官的BME和一个器官颗粒将出现在管的底部。小心去除上一液，确保避免 BME 和器官层的任何损失。将管子放在冰上。在管中加入10毫升的冰冷细胞恢复溶液，通过反转彻底混合。在冰上孵育30分钟，同时每三分钟通过反转混合一次。在此之后，在200次g下离心5分钟。当 BME 层消失时，有机颗粒应明显。如果 BME 层尺寸减小但仍可见，则在 4 摄氏度下再孵育 30 分钟，然后重复离心。一旦BME脱脂，取出细胞恢复溶液，同时留下器官颗粒。通过与反转混合，用10毫升基底介质清洗器官。在200次g下离心5分钟，取出上一代，将管内有机颗粒放在冰上至少5分钟。可选地，如果需要一个细胞制备，添加三毫升的三普辛，并辅以30微升的DNAse I溶液到器官。在37摄氏度下孵育这种酶反应，每两分钟温和反转混合10分钟。使用光明场显微镜监控并确认单细胞分离成功。为了停止酶反应，加入10毫升的冰冷基底介质，以200倍g旋转5分钟。然后取出上一液。通过温和反转混合，用 10 毫升基底介质清洗细胞。再次以200倍g离心5分钟。拆下上一液，再次重复此洗涤和离心过程。将带细胞颗粒的管子放在冰上至少五分钟。在此之后，将冰冷 BME 添加到细胞颗粒中，并使用 P200 移液器轻轻混合溶液，直到溶液均匀。然后将移液器的尖端靠近管子底部，上下移液器至少上下 5 到 10 次，以机械方式分解器官。使用 P200 移液器在预加热的 12 井板的井中央发现 100 微升圆顶。重复所有 BME 溶液分配。然后小心地将板转移到摄制箱 37 摄氏度，使 BME 凝胶凝固。10分钟后，取回盘子，并添加一毫升预热器官完整介质到每一个井。根据培养密度和增殖，有机培养通常超过7至10天。如有必要，每五天用200微升预加热的有机体完整介质对培养物进行补偿，以补偿生长因子的耗竭和蒸发。将单个细胞与器官隔离后，将单个细胞重新在人体器官完整介质的一毫升中重新暂停。接下来，使用自动单元格计数器对单元格进行计数，以确保记录单元格的生存能力。计算一毫升悬浮液中存在的细胞和可行细胞的总数。然后取出相当于40万个细胞的体积，并将其转移到一个新的管子上。将有机体完整介质添加到此管中，使体积达到 7.2 毫升。对于治疗性测试，通过将800微升BME与含有冰上细胞的7.2毫升有机体完整介质混合，为电镀细胞做好准备。将混合物转移到冰面上的储液罐中，并使用12通道移液器将这种混合物的20微升板放入384井板的每个井中，使每口井镀约1000个细胞。然后在100次g下旋转，在秋千桶中旋转一分钟，将板放入37摄氏度的组织培养箱中。24小时后，使用布莱特菲尔德显微镜检查器官是否存在。在这项研究中，患者衍生的PDAC器官被分离、扩展和特征化。为了说明与从PDAC中隔离器官相关的挑战，从一个小的低细胞肿瘤样本中建立了一种具有代表性的患者衍生器官培养。有机体允许在两周内变大，并按照协议通过，以建立一个更强大的文化。然后，来自已建立和快速增长的代表性PDAC器官的单细胞准备展示药理方案的结果。每井中镀有1000个活细胞，在细胞毒性化疗剂被给给之前，可以恢复24小时。9.0剂量测定在三钙中进行，从低剂量100皮摩尔开始，以高剂量的两微摩尔结束。经过五天的治疗后，将拍摄与车辆一起治疗的井和每种化疗剂的高剂量的有代表性的照片。拍摄照片后，立即使用发光细胞活力试剂评估细胞生存能力，并使用图形软件绘制。患者衍生的器官可以具有异质形态。因此，优化每个培养的酶分离非常重要。对患者衍生模型的下游分析通常涉及DNA和RNA的下一代测序。如果可能，使用原组织样本验证模型的分子特性。个性化器官培养为胰腺癌患者提供个性化医学方法的可能性。请记住，危险化学品，如苯酚氯仿和化疗剂，必须使用适当的 PPE 和安全设备进行处理。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

来自沙柯玛患者衍生异种移植物的肿瘤启动细胞的分离和表征

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

科研

癌症研究

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

流式细胞术对小鼠原发性胰腺导管腺癌原位同种异体 (自体) 免疫分型的研究

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

三维细胞培养中胰腺肌囊内增生的模拟与操纵

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

患者衍生的胰腺癌异质异种移植模型,使用斑马鱼幼虫作为比较药物评估的宿主

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

建立胃癌患者衍生异种移植模型和原细胞系

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

毛尿胰腺腺腺腺癌超声引导正射植入

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

分离近端液研究胰腺腺癌肿瘤微环境

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

患者衍生的中枢神经系统转移异种移植模型的建立与利用

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

建立胰腺癌斑马鱼患者来源的异种移植物进行化学敏感性测试

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...