Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

We zijn dankbaar voor de steun van de UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository en weefsel technologie gedeelde bron, leden van de Lowy laboratorium, en de UC San Diego Department of Surgery, afdeling Chirurgische oncologie. AML wordt royaal ondersteund door NIH CA155620, een SU2C CRUK Lustgarten Foundation pancreatic cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), en donoren van het Fonds om pancreaskanker te genezen.

Alle menselijke weefsel verzameling voor onderzoek gebruik werd beoordeeld en goedgekeurd door onze interne Review Board (IRB). Alle volgende protocollen worden onder aseptische omstandigheden uitgevoerd in een laboratoriumomgeving voor weefselkweek in zoogdieren.
1. Media voorbereiding
<ol><li>Geconditioneerde media voorbereiding. Opmerking: de menselijke alvleesklier organoïde media vereist overvloedige groeifactoren en voedingsstoffen evenals geconditioneerde media suppletie om voldoe...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

Hier presenteren we de huidige protocollen voor het isoleren, uitbreiden en karakteriseren van patiënten afgeleide PDAC organoïden. Ons huidige succespercentage van het oprichten van organoïde cultuur is meer dan 70%; Daarom, deze methoden zijn nog niet geperfectioneerd en worden verwacht te verbeteren en evolueren in de tijd. Er moet belangrijke aandacht worden geschonken aan de steekproefgrootte, aangezien PDAC een lage neoplastische cellulariteit heeft. Dientengevolge, kleine specimens zal bevatten weinig tumorcell...

Het pancreas adenocarcinoom (PDAC) is een dodelijke aandoening die wordt gekenmerkt door een late diagnose bij de meeste patiënten, een gebrek aan effectieve therapieën en een resulterende lage totale overlevingskans van 5 jaar die minder dan 10%1blijft. Slechts 20% van de patiënten wordt gediagnosticeerd met een gelokaliseerde ziekte die geschikt is voor curatieve chirurgische ingrepen2,3. De resterende patiënten worden doorgaans behandeld met een combinatie van chemotherapeutische middelen die werkzaam zijn bij een minderheid van de patiënten4,5. Om deze dringende klinische behoeften aan te pakken, zijn onderzoekers actief bezig met vroegtijdige detectie strategieën en de ontwikkeling van effectievere therapieën. Om de klinische vertaling van belangrijke ontdekkingen te versnellen, maken wetenschappers gebruik van genetisch gemanipuleerde muismodellen, patiënt afgeleide xenografts, monolaag cellijnen, en, meest recentelijk, organoïde modellen6.
Driedimensionale epitheliale organoïde cultuur met behulp van groeifactor en WNT-ligand rijke voorwaarden ter stimulering van de proliferatie van niet-getransformeerde voorlopercellen werden voor het eerst beschreven voor de muis darm7 en werden snel aangepast aan de normale menselijke alvleesklier weefsel8. Naast normale ductale weefsel, organoïde methodologie maakt het mogelijk voor de isolatie, uitbreiding, en studie van de menselijke PDAC8. Belangrijk is dat de methode de oprichting van organoïden uit chirurgische specimens ondersteunt, evenals fijne en kern naald biopsieën, waardoor onderzoekers alle stadia van de ziekte9,10kunnen bestuderen. Belangwekkend, patiënt-afgeleide organoïden even goed beschreven tumor Transcriptomic subtypen en kan ontwikkeling van precisie geneeskunde platformen9,11.
De huidige organoïde protocollen voor PDAC maken de succesvolle expansie van meer dan 70% van de patiënt monsters van chemo-naïeve patiënten9mogelijk. Hier presenteren we de standaardmethoden die door ons laboratorium worden gebruikt om patiënt afgeleide PDAC-organoïden te isoleren, uit te breiden en te karakteriseren. Andere organoïde methodologieën van PDAC zijn12,13 beschreven, maar geen vergelijking van deze methode is grondig uitgevoerd. Omdat deze technologie relatief nieuw is en snel vordert, verwachten we dat deze protocollen zullen blijven evolueren en verbeteren; de principes van weefselbehandeling en organoïde cultuur zullen echter nuttig blijven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

Pancreas adenocarcinoom (PDAC) behoort tot de meest dodelijke maligniteiten. Onlangs zijn de volgende-generatie organoïde cultuur methoden die de 3-dimensionale (3D) modellering van deze ziekte mogelijk maken beschreven. Patiënt-afgeleide organoïde (Bob) modellen kunnen worden geïsoleerd van zowel chirurgische specimens als kleine biopsieën en vormen snel in de cultuur. Belangrijker is dat organoïde modellen de pathogene genetische veranderingen in de tumor van de patiënt behouden en voorspellend zijn voor de behandelings respons van de patiënt, waardoor translationele studies mogelijk zijn. Hier bieden we uitgebreide protocollen voor het aanpassen van weefselcultuur workflow om 3D, matrix Embedded, organoïde modellen te bestuderen. We geven gedetailleerde methoden en overwegingen voor het isoleren en doorgeven van primaire PDAC organoïden. Verder beschrijven we hoe op maat gemaakte organoïde-media worden bereid en kwaliteitscontrole in het laboratorium. Ten slotte beschrijven we assays voor downstreamkarakterisatie van de organoïde modellen zoals isolatie van nucleïnezuren (DNA en RNA), en drug testen. Belangrijk is dat we kritische overwegingen voor de implementatie van organoïde methodologie in een onderzoek laboratorium.

Ter illustratie van de uitdagingen in verband met het isoleren van organoïden van PDAC, tonen we de oprichting van een patiënt afgeleide organoïde cultuur van een kleine hypocellulaire tumor monster. Na de initiële plating waren slechts enkele organoïden zichtbaar per put, zoals weergegeven in Figuur 1. Organoïden mochten groter worden in de periode van 2 weken en werden volgens ons protocol doorgegeven om een robuustere cultuur te creëren, zoals te zien is in de vroege en late passag...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Patiënt-afgeleide organoïde culturen van pancreas ductaal adenocarcinoom zijn een snel gevestigde 3-dimensionale model dat epitheliale tumor cel compartimenten met hoge getrouwheid vertegenwoordigen, waardoor translationeel onderzoek naar deze dodelijke maligniteit. Hier bieden we gedetailleerde methoden om organoïden te vestigen en door te geven en om relevante biologische testen uit te voeren met behulp van deze modellen.

Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Deze methode is belangrijk omdat door de patiënt afgeleide organoïde modellen een krachtig en snel hulpmiddel zijn om alvleesklierkanker te bestuderen omdat ze de genetische en fenotypische heterogeniteit van deze ziekte weerspiegelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat organoïden kunnen worden geïsoleerd met een hoog slagingspercentage van een beperkte hoeveelheid kanker en ze kunnen snel worden uitgebreid in vitro voor downstream-analyse. Het bestuderen van organoïden's reactie op cytotoxische geneesmiddelen kan ons helpen begrijpen waarom tumoren resistent worden tegen therapie en om effectievere behandelingsstrategieën te definiëren.Haal om deze procedure te starten de voorbereide 12-putplaat uit de couveuse. Met een steriele cel lifter, voorzichtig til de kelder membraan extract koepel zodanig dat het zweeft in de volledige media, terwijl ervoor te voorkomen dat schrapen de bodem van de put. Breng met behulp van een P1000 pipet de BME-koepel en de media voorzichtig over op een conische buis van 15 milliliter.Herhaal deze stap voor elke organoïde-bevattende goed. Was voorzichtig elke put die werd geoogst met een milliliter koude basale media en breng deze was naar de buis met de organoïden. Meng de oplossing en organoïden grondig met een P1000 pipet en draai vijf minuten naar beneden op 200 keer g.Aan de onderkant van de buis verschijnt een laag BME met organoïden in suspensie en een organoïde pellet. Verwijder voorzichtig de supernatant om te voorkomen dat de BME- en organoïde laag verloren gaat. Zet de buis op ijs.Voeg 10 milliliter ijskoude celterugwinningsoplossing toe aan de buis en meng grondig door inversie. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten tijdens het mengen om de drie minuten door inversie. Daarna, centrifugeren op 200 keer g gedurende vijf minuten.De organoïde pellet moet duidelijk zijn, terwijl de BME laag moet worden gegaan. Als de BME-laag kleiner is, maar nog zichtbaar is, moet u nog eens 30 minuten bij vier graden Celsius uitbroeden en de centrifugatie herhalen. Zodra de BME is gedepolymeriseerd, verwijder de cel herstel oplossing terwijl het achterlaten van de organoïde pellet.Was de organoïden met 10 milliliter basale media door te mengen met inversie. Centrifuge op 200 keer g gedurende vijf minuten, verwijder de supernatant, en plaats de buis met de organoïde pellet op ijs gedurende ten minste vijf minuten. Optioneel, als een eencellige voorbereiding gewenst is, voeg drie milliliter trypsine aangevuld met 30 microliter DNAse I oplossing voor de organoïden.Broed deze enzymatische reactie bij 37 graden Celsius met zachte inversie mengen om de twee minuten gedurende maximaal 10 minuten. Gebruik een Brightfield microscoop om te controleren en te bevestigen dat de eencellige dissociatie succesvol is. Om de enzymatische reactie te stoppen, voeg 10 milliliter ijskoude basale media toe en spin naar beneden op 200 keer g gedurende vijf minuten.Verwijder vervolgens de supernatant. Was de cellen met 10 milliliter basale media door te mengen met zachte inversie. Centrifuge opnieuw op 200 keer g gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en herhaal dit was- en centrifugingproces nog eens. Plaats de buis met de cel pellet op ijs voor ten minste vijf minuten. Voeg hierna ijskoude BME toe aan de celpellet en gebruik een P200 pipet om de oplossing voorzichtig te mengen totdat deze homogeen is.Plaats vervolgens de punt van de pipet dicht bij de bodem van de buis en pipet op en neer ten minste vijf tot 10 keer om mechanisch breken van de organoïden. Gebruik een P200 pipet om een 100 microliter koepel te spotten in het midden van een put van een voorverwarmde 12-well plaat. Herhaal dit totdat alle BME-oplossing is afgegeven.Breng de plaat vervolgens voorzichtig over naar een couveuse bij 37 graden Celsius om de BME-gel te laten stollen. Na 10 minuten, haal de plaat en voeg een milliliter van voorverwarmde organoïde complete media aan elke put. Organoïde culturen worden meestal doorgang over zeven tot 10 dagen, afhankelijk van de cultuurdichtheid en proliferatie.Indien nodig, top-up van de culturen met 200 microliters van voorverwarmde organoïde complete media om de vijf dagen te compenseren voor groeifactor uitputting en verdamping. Na het isoleren van enkele cellen van organoïden, resuspend de enkele cellen in een milliliter van menselijke organoïde complete media. Gebruik vervolgens een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen om ervoor te zorgen dat de levensvatbaarheid van de cel wordt opgenomen.Bereken het totale aantal cellen en levensvatbare cellen in de suspensie van één milliliter. Verwijder vervolgens het volume gelijk aan 400.000 cellen en breng het over naar een nieuwe buis. Voeg organoïde complete media toe aan deze buis om het volume op 7,2 milliliter te brengen.Voor therapeutische testen, bereid cellen voor beplating door het mengen van 800 microliter BME met 7,2 milliliter organoïde complete media met de cellen op ijs. Breng het mengsel naar een reservoir gehouden op ijs en gebruik een 12-kanaals pipet om 20 microliter van dit mengsel plaat in elke put van een 384-goed plaat wat resulteert in ongeveer 1,000 cellen worden verguld per goed. Draai vervolgens een minuutlang op 100 keer g in een schommelemmer naar beneden en plaats de plaat in een weefselkweek incubator op 37 graden Celsius.Gebruik na 24 uur een Brightfield microscoop om te controleren op de aanwezigheid van organoïden. In deze studie worden patiënt-afgeleide PDAC organoïde geïsoleerd, uitgebreid en gekenmerkt. Om de uitdagingen in verband met het isoleren van organoïden van PDAC te illustreren, wordt een representatieve organoïde cultuur van patiënt afgeleid vastgesteld uit een klein hypocellulair tumormonster.Organoïden mogen gedurende twee weken groter worden en worden volgens het protocol doorgang gegeven om een robuustere cultuur tot stand te brengen. Enkele cellen van een gevestigde en snelgroeiende representatieve PDAC-organoïde zijn dan bereid om de uitkomst van het farmacotyping protocol aan te tonen. 1. ,,000 levensvatbare cellen zijn verguld in elke put en mogen herstellen over een periode van 24 uur voordat de cytotoxische chemotherapeutische middelen worden gesedreerd.Een 9.0 dosistest wordt uitgevoerd in drievoud te beginnen met een lage dosis van 100 picomolar en eindigend met een hoge dosis van twee micromolar. Na een vijfdaagse behandeling worden representatieve foto's gemaakt voor putten die met het voertuig en met de hoge dosis van elk chemotherapeutisch middel worden behandeld. Onmiddellijk na het nemen van de foto's, cel levensvatbaarheid wordt beoordeeld met behulp van luminescente cel levensvatbaarheid reagens en uitgezet met behulp van grafische software.Patiënt-afgeleide organoïden kunnen heterogene morfologieën hebben. Daarom is het belangrijk om de enzymatische dissociaties voor elke cultuur te optimaliseren. Downstream-analyse van patiënt-afgeleide modellen omvat meestal de volgende generatie sequencing van het DNA en RNA.Indien mogelijk, valideren van de moleculaire kenmerken van de modellen met behulp van primaire weefselmonsters. Geïndividualiseerde organoïde culturen openen de mogelijkheid voor gepersonaliseerde geneeskunde benaderingen voor alvleesklierkanker patiënten. Houd er rekening mee dat gevaarlijke chemische stoffen zoals fenol-chloroform en chemotherapeutische agentia moeten worden behandeld met geschikte beschermingsmiddelen en veiligheidsuitrusting.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping van Orthotopic Homograft (Syngeneic) van de alvleesklier ductaal adenocarcinoom lymfkliertest primaire KPC door Stroom Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Nabootsen en manipuleren van de alvleesklier acinaire-naar-ductaal metaplasie in 3-dimensionale celcultuur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Door patiënten afgeleid heterogeen xenograft-model van pancreaskanker met behulp van zebravis larven als gastheer voor vergelijkende geneesmiddelenbeoordeling

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Echografie-geleide Orthotopic implantatie van Murine pancreatic Ductal adenocarcinoom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolatie van proximale vloeistoffen om de tumormicro-omgeving van pancreasadenocarcinoom te onderzoeken

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

De oprichting en het gebruik van patiënt-afgeleide xenograftmodellen van metastasen van het centrale zenuwstelsel

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Oprichting van zebravispatiënt-afgeleide xenografts van alvleesklierkanker voor chemosensitiviteitstests

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...