Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
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Wir sind dankbar für die Unterstützung des UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, Der Mitglieder des Lowy-Labors und der UC San Diego Department of Surgery, Division of Surgical Oncology. AML wird großzügig unterstützt von NIH CA155620, einem SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), und Spendern des Fund to Cure Pancreatic Cancer.

Alle menschlichen Gewebesammlungen für forschungstechnische Verwendung wurden von unserem Internal Review Board (IRB) überprüft und genehmigt. Alle folgenden Protokolle werden unter aseptischen Bedingungen in einer Laborumgebung für Säugetiergewebekultur durchgeführt.
1. Medienvorbereitung
<ol><li>Konditionierte Medienvorbereitung. HINWEIS: Die menschlichen Pankreasorganoid-Medien erfordert reichlich Wachstumsfaktoren und Nährstoffe sowie konditionierte Mediensupplementierung, um a...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

Hier stellen wir aktuelle Protokolle zur Isolierung, Erweiterung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten PDAC-Organoiden vor. Unsere derzeitige Erfolgsquote bei der Etablierung einer organoiden Kultur liegt bei über 70 %; daher sind diese Methoden noch nicht perfektioniert und werden sich im Laufe der Zeit verbessern und weiterentwickeln. Die Stichprobengröße sollte in Betracht gezogen werden, da PDAC eine geringe neoplastische Zellulizität hat. Folglich enthalten kleine Proben nur wenige Tumorzellen und erze...

Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDAC) ist eine tödliche Erkrankung, die durch eine späte Diagnose bei den meisten Patienten, einen Mangel an wirksamen Therapien und eine daraus resultierende niedrige 5-Jahres-Gesamtüberlebensrate gekennzeichnet ist, die unter 10%1bleibt. Nur 20% der Patienten werden mit einer lokalisierten Krankheit diagnostiziert, die für den kurativen chirurgischen Eingriff geeignet ist2,3. Die übrigen Patienten werden in der Regel mit einer Kombination von Chemotherapeutika behandelt, die bei einer Minderheit der Patienten wirksam sind4,5. Um diesen dringenden klinischen Bedürfnissen gerecht zu werden, arbeiten die Forscher aktiv an Früherkennungsstrategien und der Entwicklung wirksamerer Therapien. Um die klinische Übersetzung wichtiger Entdeckungen zu beschleunigen, verwenden Wissenschaftler gentechnisch veränderte Mausmodelle, von Patienten abgeleitete Xenografts, monolayer Zelllinien und zuletzt Organoidmodelle6.
Dreidimensionale epitheliale Organoidkultur mit Wachstumsfaktor und Wnt-Ligand-reichen Bedingungen zur Stimulierung der Proliferation von untransformierten Vorläuferzellen wurden zuerst für den Mausdarmbeschrieben 7 und wurden schnell an normales menschliches Bauchspeicheldrüsengewebe angepasst8. Zusätzlich zu normalen duktalen Gewebe, Organoid-Methodik ermöglicht die Isolierung, Expansion, und Studie des menschlichen PDAC8. Wichtig ist, dass die Methode die Etablierung von Organoiden aus chirurgischen Proben sowie Feine und Kernnadelbiopsien unterstützt, so dass Forscher alle Stadien der Krankheit9,10untersuchen können. Interessanterweise rekapitulieren patientenabgeleitete Organoide gut beschriebene Tumortranskriptomik-Subtypen und können die Entwicklung von Präzisionsmedizinplattformen9,11ermöglichen.
Aktuelle Organoidprotokolle für PDAC ermöglichen die erfolgreiche Erweiterung von mehr als 70% der Patientenproben von chemonaiven Patienten9. Hier stellen wir die Standardmethoden unseres Labors zur Isolierung, Erweiterung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten PDAC-Organoiden vor. Andere ORGANoide PDAC-Methoden wurden beschrieben12,13 aber es wurde kein Vergleich dieser Methode durchgeführt. Da diese Technologie relativ neu ist und schnell voranschreitet, erwarten wir, dass sich diese Protokolle weiterentwickeln und verbessern werden; die Prinzipien der Gewebehandhabung und der organoiden Kultur werden jedoch weiterhin nützlich sein.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDAC) gehört zu den tödlichsten Malignitäten. Kürzlich wurden Organoidkulturmethoden der nächsten Generation beschrieben, die die dreidimensionale (3D) Modellierung dieser Krankheit ermöglichen. Patientenabgeleitete Organoidmodelle (g.U.) können sowohl aus chirurgischen Proben als auch aus kleinen Biopsien isoliert werden und sich schnell in der Kultur bilden. Wichtig ist, dass Organoidmodelle die pathogenen genetischen Veränderungen, die im Tumor des Patienten festgestellt wurden, erhalten und die Behandlungsreaktion des Patienten vorhersagen und so translationale Studien ermöglichen. Hier bieten wir umfassende Protokolle zur Anpassung des Gewebekultur-Workflows zur Untersuchung von 3D-, Matrix-Eingebetteten, Organoidmodellen. Wir beschreiben Methoden und Überlegungen zur Isolierung und Verbreitung primärer PDAC-Organoide. Darüber hinaus beschreiben wir, wie maßgeschneiderte organoide Medien im Labor hergestellt und qualitätskontrolliert werden. Schließlich beschreiben wir Assays zur nachgelagerten Charakterisierung der Organoidmodelle wie Isolierung von Nukleinsäuren (DNA und RNA) und Arzneimitteltests. Wichtig ist, dass wir kritische Überlegungen für die Implementierung der organoiden Methodik in einem Forschungslabor liefern.

Um die Herausforderungen zu veranschaulichen, die mit der Isolierung von Organoiden aus PDAC verbunden sind, zeigen wir die Etablierung einer patientenabgeleiteten Organoidkultur aus einer kleinen hypozellulären Tumorprobe. Nach der ersten Beschichtung waren nur wenige Organoide pro Brunnen sichtbar, wie in Abbildung 1dargestellt. Organoide durften über einen Zeitraum von 2 Wochen größer werden und wurden gemäß unserem Protokoll durchdrungen, um eine robustere Kultur zu etablieren, wie...

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Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Patientenabgeleitete organoide Kulturen des pankreatischen duktodalen Adenokarzinoms sind ein schnell etabliertes dreidimensionales Modell, das epitheliale Tumorzellkompartimente mit hoher Genauigkeit darstellt und translationale Forschung entoliert. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Etablierung und Vermehrung von Organoiden sowie zur Durchführung relevanter biologischer Assays mit diesen Modellen.

Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Diese Methode ist wichtig, da vom Patienten abgeleitete Organoidmodelle ein leistungsfähiges und schnelles Werkzeug sind, um Bauchspeicheldrüsenkrebs zu untersuchen, da sie die genetische und phänotypische Heterogenität dieser Krankheit widerspiegeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Organoide mit einer hohen Erfolgsrate von einer begrenzten Krebsmenge isoliert und für die nachgelagerte Analyse schnell in vitro erweitert werden können. Das Studium der Reaktion von Organoiden auf zytotoxische Medikamente kann uns helfen zu verstehen, warum Tumore resistent gegen Therapie werden und effektivere Behandlungsstrategien definieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, rufen Sie die vorbereitete 12-Well-Platte aus dem Inkubator ab. Mit einem sterilen Zellheber, heben Sie vorsichtig die Keller Membran-Extrakt-Kuppel so, dass es in der gesamten Medien schwebt, während sie sicherstellen, dass nicht kratzen den Boden des Brunnens. Mit einer P1000 Pipette übertragen Sie die BME-Kuppel und die Medien vorsichtig auf ein 15 Milliliter Konikonrohr.Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden organoidhaltigen Brunnen. Waschen Sie jeden Brunnen, der mit einem Milliliter kalter Basalmedien geerntet wurde, sanft und übertragen Sie ihn auf das Rohr mit den Organoiden. Die Lösung und die Organoide mit einer P1000 Pipette gründlich mischen und fünf Minuten lang bei 200 mal g nach unten drehen.Eine Schicht von BME, die Organoide in Suspension und ein Organoidpellet enthält, erscheint an der Unterseite des Rohres. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und stellen Sie sicher, dass ein Verlust der BME- und Organoidschicht vermieden wird. Legen Sie die Röhre auf Eis.Fügen Sie 10 Milliliter eiskalte Zell-Recovery-Lösung in die Röhre und gründlich durch Inversion mischen. Auf Eis für 30 Minuten inkubieren, während alle drei Minuten durch Inversion gemischt. Danach zentrifugieren Sie bei 200 mal g für fünf Minuten.Das Organoidpellet sollte sichtbar sein, während die BME-Schicht weg sein sollte. Wenn die BME-Schicht verkleinert, aber immer noch sichtbar ist, weitere 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren und die Zentrifugation wiederholen. Sobald das BME depolymerisiert wurde, entfernen Sie die Zellrückgewinnungslösung, während Sie das Organoidpellet zurücklassen.Waschen Sie die Organoide mit 10 Milliliter n.A. Basalmedien, indem Sie sie mit Inversion mischen. Zentrifugieren Sie bei 200 mal g für fünf Minuten, entfernen Sie den Überstand, und legen Sie das Rohr mit dem Organoidpellet auf Eis für mindestens fünf Minuten. Optional, wenn eine einzelzellige Zubereitung gewünscht wird, fügen Sie drei Milliliter Trypsin mit 30 Mikroliter DNAse I Lösung zu den Organoiden ergänzt.Inkubieren Sie diese enzymatische Reaktion bei 37 Grad Celsius mit sanfter Inversion, die alle zwei Minuten für bis zu 10 Minuten gemischt wird. Verwenden Sie ein Brightfield-Mikroskop, um zu überwachen und zu bestätigen, dass die Einzelzelldissoziation erfolgreich ist. Um die enzymatische Reaktion zu stoppen, fügen Sie 10 Milliliter eiskalte Basalmedien hinzu und drehen Sie sich fünf Minuten lang bei 200 mal g.Entfernen Sie dann den Überstand. Waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter n.A. Basalmedien, indem Sie sie mit sanfter Inversion mischen. Zentrifugieren Sie wieder bei 200 mal g für fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie diesen Wasch- und Zentrifugierungsprozess noch einmal. Legen Sie das Rohr mit dem Zellpellet mindestens fünf Minuten auf Eis. Danach eiskaltes BME in das Zellpellet geben und eine P200 Pipette verwenden, um die Lösung sanft zu mischen, bis sie homogen ist.Dann legen Sie die Spitze der Pipette in der Nähe der Unterseite des Rohres und Pipette nach oben und unten mindestens fünf bis zehn Mal, um die Organoide mechanisch aufzubrechen. Verwenden Sie eine P200 Pipette, um eine 100-Mikroliter-Kuppel in der Mitte eines Brunnens einer vorgewärmten 12-Well-Platte zu erkennen. Wiederholen Sie dies, bis die gesamte BME-Lösung ausgegeben wird.Dann die Platte vorsichtig auf einen Inkubator bei 37 Grad Celsius übertragen, damit sich das BME-Gel erstarren lässt. Nach 10 Minuten, holen Sie die Platte und fügen Sie einen Milliliter vorgewärmte Organoid komplette Medien zu jedem Brunnen. Organoidkulturen werden in der Regel über sieben bis zehn Tage je nach Kulturdichte und Proliferation durchdrungen.Falls erforderlich, die Kulturen alle fünf Tage mit 200 Mikrolitern vorgewärmten Organoid-Komplettmedien auffüllen, um die Erschöpfung und Verdunstung des Wachstumsfaktors auszugleichen. Nach der Isolierung einzelner Zellen von Organoiden, resuspendieren Sie die einzelnen Zellen in einem Milliliter menschlichen organoiden vollständigen Medium. Verwenden Sie als Nächstes einen automatisierten Zellenzähler, um die Zellen zu zählen, um sicherzustellen, dass die Zelllebensfähigkeit erfasst wird.Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und lebensfähigen Zellen, die in der Ein-Milliliter-Suspension vorhanden sind. Entfernen Sie dann das Volumen, das 400.000 Zellen entspricht, und übertragen Sie es in ein neues Rohr. Fügen Sie organoide komplette Medien zu dieser Röhre hinzu, um das Volumen auf 7,2 Milliliter zu erhöhen.Für therapeutische Tests bereiten Sie Zellen für die Beschichtung vor, indem Sie 800 Mikroliter BME mit 7,2 Milliliterorganoid-Komplettmedien mischen, die die Zellen auf Eis enthalten. Übertragen Sie die Mischung in ein auf Eis gehaltenes Reservoir und verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um 20 Mikroliter dieser Mischung in jeden Brunnen einer 384-Well-Platte zu verbuchen, was dazu führt, dass ca. 1.000 Zellen pro Brunnen plattiert werden. Dann drehen Sie die Platte bei 100 mal g für eine Minute in einem Schwenkeimer und legen Sie die Platte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.Nach 24 Stunden verwenden Sie ein Brightfield-Mikroskop, um das Vorhandensein von Organoiden zu überprüfen. In dieser Studie werden patientenabgeleitete PDAC-Organoide isoliert, erweitert und charakterisiert. Um die Herausforderungen zu veranschaulichen, die mit der Isolierung von Organoiden aus PDAC verbunden sind, wird aus einer kleinen hypozellulären Tumorprobe eine repräsentative, vom Patienten abgeleitete Organoidkultur gebildet.Organoide dürfen über einen Zeitraum von zwei Wochen größer werden und werden gemäß dem Protokoll durchgehen, um eine robustere Kultur zu etablieren. Einzelne Zellen aus einem etablierten und schnell wachsenden repräsentativen PDAC-Organoid werden dann vorbereitet, um das Ergebnis des Pharmakotypisierungsprotokolls zu demonstrieren. 1.000 lebensfähige Zellen werden in jedem Brunnen plattiert und können sich über einen Zeitraum von 24 Stunden erholen, bevor die zytotoxischen Chemotherapeutika dosiert werden.Ein 9,0-Dosis-Assay wird in Dreifacharbeit durchgeführt, beginnend mit einer niedrigen Dosis von 100 Picomolar und endet mit einer hohen Dosis von zwei Mikromolaren. Nach einer fünftägigen Behandlung werden repräsentative Bilder für mit dem Fahrzeug behandelte Brunnen und mit der hohen Dosis jedes Chemotherapeutikums aufgenommen. Unmittelbar nach der Aufnahme der Bilder wird die Zelllebensfähigkeit mit einem lumineszierenden Zelllebensfähigkeitsreagenz bewertet und mit Graphik-Software gezeichnet.Patienten-abgeleitete Organoide können heterogene Morphologien haben. Daher ist es wichtig, die enzymatischen Dissoziationen für jede einzelne Kultur zu optimieren. Die nachgelagerte Analyse von Patientenmodellen beinhaltet in der Regel eine Sequenzierung der DNA und der RNA der nächsten Generation.Validieren Sie nach Möglichkeit die molekularen Eigenschaften der Modelle anhand von primären Gewebeproben. Individualisierte Organoidkulturen eröffnen die Möglichkeit personalisierter medizinischer Ansätze für Patienten mit Bauchspeicheldrüsenkrebs. Denken Sie daran, dass gefährliche Chemikalien wie Phenol-Chlor-Form und Chemotherapeutika mit geeigneten PSA und Sicherheitsausrüstung behandelt werden müssen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Forschung

Krebsforschung

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patientenabgeleitetes heterogenes Xenograft-Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs mit Zebrafischlarven als Wirte für vergleichende Arzneimittelbewertung

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolierung proximaler Flüssigkeiten zur Untersuchung der Tumormikroumgebung des Pankreas-Adenokarzinoms

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Etablierung von Zebrafisch-Xenotransplantaten aus Bauchspeicheldrüsenkrebs für Chemosensitivitätstests

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms