Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

אנו אסירי תודה על תמיכתם של מרכז הסרטן בסן דייגו מורס ביווריפוזיטורי וטכנולוגיית רקמה משותפת, חברי המעבדה Lowy, ואת המחלקה לכירורגיה בסן דייגו של ה-UC, חטיבה של אונקולוגיה כירורגית. AML נתמך בנדיבות על ידי NIH CA155620, SU2C CRUK קרן Lustgarten בסיס לסרטן הלבלב החלום פרס הקבוצה (SU2C-AACR-DT-20-16), ותורמים לקרן לרפא סרטן הלבלב.

כל אוסף רקמת האדם לשימוש מחקר נבדק ואושר על ידי לוח הסקירה הפנימי שלנו (IRB). כל הפרוטוקולים הבאים מתבצעים בתנאים אספטי בסביבת המעבדה לתרבות רקמת היונקים.
1. הכנת מדיה
<ol><li>הכנה למדיה ממוזגת. הערה: התקשורת האנושית אורגאיד הלבלב דורש גורמים צמיחה שופע חומרים מזינים, כמו גם תוס...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הנוכחיים לבידוד, הרחבה ואפיון של מטופלים שמקורם בארגון PDAC. שיעור ההצלחה הנוכחי שלנו של הקמת תרבות ארגונית הוא מעל 70%; לכן, שיטות אלה עדיין לא שלמות וצפויים לשפר ולהתפתח עם הזמן. יש להתחשב בגודל המדגם, בדומה ל-PDAC בעל cellularity-הנאופלסטית נמוכה. כתוצאה מכך, דגימות קט?...

מחלת הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) היא מחלה קטלנית המאופיינת אבחנה מאוחרת ברוב החולים, חוסר טיפולים יעילים, ושיעור כתוצאה נמוכה 5-שנה הישרדות הכוללת שנשאר פחות מ 10%1. רק 20% מהחולים מאובחנים עם מחלה מקומית מתאים התערבות כירורגית מרפא2,3. המטופלים הנותרים מטופלים בדרך כלל עם שילוב של סוכני כימותרפיה כי הם יעילים במיעוט של חולים4,5. כדי לענות על הצרכים הקליניים הדחופים האלה, חוקרים עובדים באופן פעיל על אסטרטגיות גילוי מוקדם ופיתוח של טיפולים יעילים יותר. כדי להאיץ את התרגום הקליני של תגליות חשובות, מדענים מהונדסים גנטית מודלים העכבר, החולה נגזר xenografts תלי, מונאולייר תאים קווים, ו, לאחרונה, מודלים אורגאיד6.
תרבות תלת ממדית האפיתל אורגאיד באמצעות גורם הצמיחה ו-Wnt-ligand התנאים עשיר כדי לעורר התפשטות של תאים מחולל שינוי לראשונה תוארו על מעיים העכבר7 והותאמו במהירות לרקמת הלבלב האנושי נורמלי8. בנוסף רקמת דוטל רגילה, מתודולוגיה ארגונית מאפשרת בידוד, התרחבות, ולימוד של האדם PDAC8. חשוב לעשות זאת, השיטה תומכת בהקמת אורגנואידים מדגימות כירורגי, כמו גם ביופסיות מחט בסדר הליבה, המאפשר לחוקרים ללמוד את כל שלבי המחלה9,10. מעניין, מטופל נגזר החולה לכידה היטב מתוארים הגידול תת-ממדי והוא עשוי לאפשר פיתוח של פלטפורמות רפואה מדויקת9,11.
הפרוטוקולים הנוכחיים של הארגון עבור PDAC מאפשרים הרחבה מוצלחת של יותר מ-70% מדגימות המטופלים ממטופלים תמימים מכימותרפיה9. כאן אנו מציגים את האמצעים הסטנדרטיים המועסקים על ידי המעבדה שלנו כדי לבודד, להרחיב, ולאפיין את החולה הנגזרות PDAC אורגנואידים. מתודולוגיות משנה נוספות של pdac מתוארות12,13 אך לא השוואה של שיטה זו בוצעה ביסודיות. כאשר טכנולוגיה זו היא חדשה יחסית ומתקדמת מהר, אנו מצפים כי פרוטוקולים אלה ימשיכו להתפתח ולשפר; עם זאת, העקרונות של הטיפול ברקמה ותרבות אורגאידית ימשיכו להיות שימושיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

לבלב הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) הוא בין ממאירות קטלנית ביותר. לאחרונה, הדור הבא שיטות תרבות אורגאיד המאפשרות מידול תלת מימדי (3D) של מחלה זו תוארה. מודלים מסוג אורגאיד הנגזר מהמטופל (PDO) יכולים להיות מבודדים הן מדגימות הניתוח והן מהביופסיה הקטנה והצורה במהירות בתרבות. חשוב מכך, מודלים אורגנואיד לשמר את השינויים הגנטיים הפתוגניים שזוהו בגידול של המטופל, הם ניבוי של תגובת הטיפול של המטופל, ובכך מאפשר מחקרים טרנסלבותית. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מקיפים להתאמת זרימת העבודה של תרבות רקמות כדי ללמוד 3D, מטריקס מוטבע, מודלים אורגנואיד. אנו מפרטים שיטות ושיקולים עבור בידוד והפצת הראשי PDAC אורגנואידים. יתר על כן, אנו מתארים כיצד מדיה אורגאיד העידו מוכן איכות בשליטה במעבדה. לבסוף, אנו מתארים בחני האפיון המטה של מודלים אורגנואיד כגון בידוד של חומצות גרעין (DNA ו-RNA), ובדיקות סמים. חשוב לציין שיקולים קריטיים ליישום מתודולוגיה ארגונית במעבדת מחקר.

כדי להמחיש את האתגרים הקשורים עם בידוד אורגנואידים מ PDAC, אנו מראים את הקמתה של החולה מטופל התרבות האורגאידית מדגימה קטנה hypocellular הגידול. לאחר ציפוי ראשוני, רק כמה אורגנואידים היו גלויים לעין, כפי שמוצג באיור 1. לאורגנואידים הורשו לגדול במשך השבוע השני והיו מעבר בהתאם לפרוטו?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

המטופל-התרבויות הנגזרות של הלבלב אדנוקרצינומה הם מודל תלת מימדי מבוסס במהירות המייצגים תאים סרטניים אפיתל הגידול עם נאמנות גבוהה, המאפשר מחקר טרנסלtional לתוך זה ממאירות קטלני. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות כדי ליצור ולהפיץ אורגנואידים, כמו גם לבצע מאמר ביולוגי רלוונטי באמצעות מודלים אלה.

בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

שיטה זו משמעותית מכיוון שמודלים אורגנואידיים שמקורם בחולה הם כלי רב עוצמה ומהיר לחקר סרטן הלבלב מכיוון שהם משקפים את ההטרוגניות הגנטית והפנוטיפית של מחלה זו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא אורגנואידים ניתן לבודד עם שיעור הצלחה גבוה מכמות מוגבלת של סרטן והם יכולים להיות מורחבים במהירות במבחנה לניתוח במורד הזרם. לימוד התגובה של אורגנואידים לתרופות ציטוטוקסיות עשוי לעזור לנו להבין מדוע גידולים הופכים עמידים לטיפול ולהגדיר אסטרטגיות טיפול יעילות יותר.כדי להתחיל בהליך זה, לאחזר את צלחת 12 באר מוכן מן החממה. עם מרים תא סטרילי, בעדינות להרים את כיפה תמצית קרום המרתף כך שהוא צף במדיה המלאה תוך הקפדה להימנע מגרד את החלק התחתון של הבאר. באמצעות פיפטה P1000, בזהירות להעביר את כיפת BME ואת התקשורת לצינור חרוט 15 מיליליטר.חזור על שלב זה עבור כל באר המכילה אורגנואידים. לשטוף בעדינות כל באר שנקטפו עם מיליליטר אחד של מדיה בזלית קרה ולהעביר את זה לשטוף את הצינור המכיל את האורגנואידים. מערבבים היטב את הפתרון ואת האורגנואידים עם פיפטה P1000 ומסתובבים למטה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.שכבה של BME המכיל אורגנואידים בהשעיה וכדור אורגנואיד יופיע בתחתית הצינור. בזהירות להסיר את supernatant הקפד למנוע כל אובדן של BME ושכבת organoid. מניחים את הצינור על קרח.מוסיפים 10 מיליליטר של פתרון התאוששות תאים קרים כקרח לצינור ומערבבים ביסודיות על ידי היפוך. דגירה על קרח במשך 30 דקות תוך ערבוב כל שלוש דקות על ידי היפוך. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.גלולת organoid צריך להיות ברור בעוד שכבת BME צריך להיות נעלם. אם שכבת BME פוחתת בגודלה אך עדיין נראית לעין, דגירה למשך 30 דקות נוספות בארבע מעלות צלזיוס וחוזרת על הצנטריפוגה. לאחר BME כבר depolymerized, להסיר את פתרון שחזור התא תוך השארת מאחור גלולה organoid.לשטוף את האורגנואידים עם 10 מיליליטר של מדיה בזלית על ידי ערבוב עם היפוך. צנטריפוגה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות, להסיר את supernatant, ולה מניחים את הצינור עם גלולה organoid על הקרח לפחות חמש דקות. באופן אופציונלי, אם הכנת תא יחיד רצוי, להוסיף שלושה מיליליטר של טריפסין בתוספת 30 microliters של פתרון DNAse אני האורגנואידים.הדגירה תגובה אנזימטית זו ב 37 מעלות צלזיוס עם היפוך עדין ערבוב כל שתי דקות עד 10 דקות. השתמש במיקרוסקופ של Brightfield כדי לפקח ולאשר שהדיסוציאציה של תא יחיד הצליחה. כדי לעצור את התגובה האנזימטית, להוסיף 10 מיליליטר של מדיה בזלית קרה קרח להסתובב למטה ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.ואז להסיר את העל-טבעי. לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של מדיה בזלית על ידי ערבוב עם היפוך עדין. צנטריפוגה שוב ב 200 פעמים g במשך חמש דקות.הסר את העל-טבעי וחזור על תהליך שטיפה וצנטריפוגה זה פעם נוספת. מניחים את הצינור עם גלולת התא על קרח לפחות חמש דקות. לאחר מכן, להוסיף קרח קר BME לכדור התא ולהשתמש פיפטה P200 לערבב את הפתרון בעדינות עד שהוא הומוגני.ואז למקם את קצה פיפטה קרוב לתחתית הצינור פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש עד 10 פעמים כדי לשבור מכנית את האורגנואידים. השתמשו בפיגט P200 כדי לזהות כיפת 100 מיקרוליטר במרכז באר של צלחת 12 בארות מחוממת מראש. חזור על הפעולה עד שכל פתרון ה- BME יפונה.לאחר מכן מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לג'ל BME להתגבש. לאחר 10 דקות, לאחזר את הצלחת ולהוסיף מיליליטר אחד של מדיה מלאה organoid מחומם מראש לכל באר. תרבויות אורגנואידיות בדרך כלל מעבר על פני שבעה עד 10 ימים בהתאם לצפיפות התרבות והתפשטות.במידת הצורך, למעלה התרבויות עם 200 microliters של מדיה מלאה organoid מחומם מראש כל חמישה ימים כדי לפצות על דלדול גורם גדילה התאדות. לאחר בידוד תאים בודדים מאיברנואידים, יש לתרום מחדש את התאים הבודדים במיליליטר אחד של מדיה שלמה של אורגנואיד אנושי. לאחר מכן, השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים המוודאים לתעד את הכדאיות של התא.חשב את המספר הכולל של תאים ותאים בני קיימא הקיימים בהשעיה של מיליליטר אחד. לאחר מכן הסר את אמצעי האחסון השווה ל- 400, 000 תאים והעבר אותו לצינור חדש. הוסף מדיה מלאה organoid לצינור זה כדי להביא את עוצמת הקול עד 7.2 מיליליטר.לבדיקות טיפוליות, הכינו תאים לבדיקה על ידי ערבוב של 800 מיקרוליטרים של BME עם 7.2 מיליליטר של מדיה מלאה אורגנואידית המכילה את התאים על הקרח. מעבירים את התערובת למאגר שנשמר על קרח ולהשתמש פיפטה 12 ערוצים כדי צלחת 20 microliters של תערובת זו לתוך כל באר של צלחת 384 באר וכתוצאה מכך כ 1,000 תאים להיות מצופה לתוך באר. ואז לסובב את הצלחת ב 100 פעמים גרם במשך דקה אחת בדלי נדנדה ולה מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור תרבות רקמות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ של ברייטפילד כדי לבדוק נוכחות של אורגנואידים. במחקר זה, אורגנואיד PDAC שמקורו בחולה מבודדים, מורחבים ומאופיינים. כדי להמחיש את האתגרים הקשורים בידוד אורגנואידים מ PDAC, תרבות אורגנואידית המטופל הייצוגי הוקמה מדגם גידול צבוע קטן.אורגנואידים מורשים לגדול על פני שבועיים והם מעבר על פי הפרוטוקול כדי להקים תרבות חזקה יותר. תאים בודדים מ organoid PDAC נציג הוקמה וגדל במהירות מוכנים לאחר מכן כדי להדגים את התוצאה של פרוטוקול פרמקוטיפינג. 1, 000 תאים קיימא מצופים בכל באר מותר להתאושש על פני תקופה של 24 שעות לפני סוכנים כימותרפיים cytotoxic הם מינון.בדיקה במינון 9.0 מבוצעת ב- triplicate החל במינון נמוך של 100 פיקומולר וכלה במינון גבוה של שני מיקרומולרים. לאחר טיפול של חמישה ימים, תמונות נציג נלקחים עבור בארות שטופלו ברכב עם המינון הגבוה של כל סוכן כימותרפי. מיד לאחר צילום התמונות, הכדאיות התא מוערך באמצעות reagent הכדאיות התא זוהר התווה באמצעות תוכנת גרפים.אורגנואידים שמקורם בחולה יכולים להיות מורפולוגיות הטרוגניים. לכן, חשוב לייעל את הדיסוציאציות האנזימטיות לכל תרבות. ניתוח במורד הזרם של מודלים שמקורם במטופלים כרוך בדרך כלל ברצף הדור הבא של הדנ"א וה-RNA.במידת האפשר, לאמת את המאפיינים המולקולריים של המודלים באמצעות דגימות רקמה ראשוניות. תרבויות אורגנואידיות אינדיבידואליות פותחות את האפשרות לגישות רפואה מותאמות אישית לחולי סרטן הלבלב. זכור כי כימיקלים מסוכנים כגון פנול-כלורופורם וסוכנים כימותרפיים חייבים להיות מטופלים עם PPE מתאים וציוד בטיחות.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

מחקה וטיפול מטפלזיה Acinar-כדי-Ductal הלבלב בתרבות תלת-ממדי תא

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

אולטרה סאונד-הדרכה אורתודפית של הלבלב מורלין אדנוקרצינומה

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

הקמה וניצול של מודלים Xenograft נגזר המטופל של גרורות במערכת העצבים המרכזית

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...