Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

Siamo grati per il supporto dell'UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, membri del laboratorio Lowy, e del Dipartimento di Chirurgia UC San Diego, Divisione di Oncologia Chirurgica. AML è generosamente sostenuta da NIH CA155620, un SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), e donatori del Fondo per la cura del cancro pancreatico.

Tutta la raccolta di tessuti umani per uso di ricerca è stata rivista e approvata dal nostro Internal Review Board (IRB). Tutti i seguenti protocolli vengono eseguiti in condizioni asettiche in un ambiente di laboratorio di coltura dei tessuti mammiferi.
1. Preparazione dei supporti
<ol><li>Preparazione dei supporti condizionati. NOTA: I supporti organoidi pancreatici umani richiedono abbondanti fattori di crescita e sostanze nutritive, nonché il completamento dei supporti condizionati ...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

Qui presentiamo i protocolli attuali per isolare, espandere e caratterizzare gli organoidi PDAC derivati dal paziente. Il nostro attuale tasso di successo nell'stabilire la cultura organoide è superiore al 70%; pertanto, questi metodi non sono ancora stati perfezionati e si prevede che miglioreranno ed evolvono nel tempo. Si dovrebbe considerare importante la dimensione del campione, in quanto il PDAC ha una bassa cellularità neoplastica. Di conseguenza, piccoli esemplari conterranno poche cellule tumorali e genererann...

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una malattia letale caratterizzata da diagnosi tardiva nella maggior parte dei pazienti, mancanza di terapie efficaci e un basso tasso di sopravvivenza globale a 5 anni che rimane inferiore al 10%1. Solo il 20% dei pazienti viene diagnosticato con una malattia localizzata adatta per l'intervento chirurgico curativo2,3. I restanti pazienti sono tipicamente trattati con una combinazione di agenti chemioterapici che sono efficaci in una minoranza di pazienti4,5. Per rispondere a queste pressanti esigenze cliniche, i ricercatori stanno lavorando attivamente su strategie di diagnosi precoce e sullo sviluppo di terapie più efficaci. Per accelerare la traduzione clinica di importanti scoperte, gli scienziati stanno impiegando modelli murini geneticamente ingegnerizzati, xenotrapianto derivati dal paziente, linee di cellule monostrato e, più recentemente, modelli organoidi6.
La coltura organoide epiteliale tridimensionale utilizzando il fattore di crescita e le ricche condizioni Wnt-ligand per stimolare la proliferazione delle cellule progenitrici non trasformate sono state descritte per la prima volta per l'intestino del topo7 e sono state rapidamente adattate al normale tessuto pancreatico umano8. Oltre al normale tessuto duttale, la metodologia organoide consente l'isolamento, l'espansione e lo studio del PDAC8umano. È importante sottolineare che il metodo supporta la creazione di organoidi da campioni chirurgici, così come biopsie di aghi fini e core, permettendo ai ricercatori di studiare tutte le fasi della malattia9,10. È interessante notare che gli organoidi derivati dal paziente riassumono sottotipi trascrittomici tumorali ben descritti e possono consentire lo sviluppo di piattaforme di medicina di precisione9,11.
Gli attuali protocolli organoidi per il PDAC consentono il successo dell'espansione di oltre il 70% dei campioni di pazienti da pazienti chemio-naive9. Qui presentiamo i metodi standard impiegati dal nostro laboratorio per isolare, espandere e caratterizzare gli organoidi PDAC derivati dal paziente. Altre metodologie organoidi PDAC sono state descritte12,13 ma nessun confronto di questi metodi è stato accuratamente eseguito. Poiché questa tecnologia è relativamente nuova e avanza rapidamente, prevediamo che questi protocolli continueranno ad evolversi e migliorare; tuttavia i principi della manipolazione dei tessuti e della coltura organoide continueranno ad essere utili.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è tra le neoplasie più letali. Recentemente, sono stati descritti metodi di coltura organoide di nuova generazione che consentono la modellazione tridimensionale (3D) di questa malattia. I modelli organoidi (PDO) derivati dal paziente possono essere isolati sia da campioni chirurgici che da piccole biopsie e si formano rapidamente nella coltura. È importante sottolineare che i modelli organoidi conservano le alterazioni genetiche patogene rilevate nel tumore del paziente e sono predittivi della risposta al trattamento del paziente, consentendo così studi traslazionali. Qui, forniamo protocolli completi per adattare il flusso di lavoro della coltura tissutale per studiare modelli 3D, a matrice incorporata e organoidi. Vengono descritti in dettaglio i metodi e le considerazioni per l'isolamento e la propagazione degli organoid PDAC primari. Inoltre, descriviamo come i supporti organoidi su misura sono preparati e la qualità controllata in laboratorio. Infine, descriviamo i saggi per la caratterizzazione a valle dei modelli organoidi come l'isolamento degli acidi nucleici (DNA e RNA) e il test farmacologico. È importante sottolineare che forniamo considerazioni critiche per l'implementazione della metodologia organoide in un laboratorio di ricerca.

Per illustrare le sfide associate all'isolamento degli organoidi dal PDAC, mostriamo la creazione di una coltura organoide derivata dal paziente da un piccolo campione di tumore ipocellulare. Dopo la placcatura iniziale, solo pochi organoidi erano visibili per bene, come mostrato Figura 1. Gli organiidi sono stati autorizzati a crescere più grande nel corso della durata di 2 settimane e sono stati passaggi secondo il nostro protocollo per stabilire una cultura più robusta, come mostrato ne...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Le colture organoidi derivate dal paziente dell'adenocarcinoma duttale pancreatico sono un modello tridimensionale rapidamente stabilito che rappresenta i compartimenti delle cellule tumorali epiteliali con alta fedeltà, consentendo la ricerca traslazionale in questa malignità letale. Qui, forniamo metodi dettagliati per stabilire e propagare gli organoidi, nonché per eseguire saggi biologici pertinenti utilizzando questi modelli.

Isolamento e caratterizzazione dei modelli organoidi dell'adenocarcinoma duttale pancreatico derivato dal paziente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Questo metodo è significativo perché i modelli organoidi derivati dal paziente sono uno strumento potente e rapido per studiare il cancro al pancreas in quanto riflettono l'eterogeneità genetica e fenotipica di questa malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli organoidi possono essere isolati con un alto tasso di successo da una quantità limitata di cancro e possono essere espansi rapidamente in vitro per l'analisi a valle. Studiare la risposta degli organoidi ai farmaci citotossici può aiutarci a capire perché i tumori diventano resistenti alla terapia e a definire strategie di trattamento più efficaci.Per iniziare questa procedura, recuperare la piastra preparata da 12 pozzi dall'incubatore. Con un sollevatore a celle sterile, sollevare delicatamente la cupola di estrazione della membrana basale in modo che galleggia nel supporto completo assicurandosi di evitare di raschiare il fondo del pozzo. Utilizzando una pipetta P1000, trasferire accuratamente la cupola BME e il supporto su un tubo conico da 15 millilitri.Ripetere questo passaggio per ogni pozzo contenente organoidi. Lavare delicatamente ogni pozzo raccolto con un millilitro di mezzi basali freddi e trasferire questo lavaggio sul tubo contenente gli organoidi. Mescolare accuratamente la soluzione e gli organoidi con una pipetta P1000 e girare verso il basso a 200 volte g per cinque minuti.Uno strato di BME contenente organoidi in sospensione e un pellet organoide apparirà nella parte inferiore del tubo. Rimuovere con cura il supernatante assicurandosi di evitare qualsiasi perdita del BME e dello strato organoide. Metti il tubo sul ghiaccio.Aggiungere 10 millilitri di soluzione di recupero delle celle fredde di ghiaccio al tubo e mescolare accuratamente per inversione. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti mescolando ogni tre minuti per inversione. Dopo questo, centrifuga a 200 volte g per cinque minuti.Il pellet organoide dovrebbe essere evidente mentre lo strato di BME dovrebbe essere sparito. Se lo strato di BME è di dimensioni ridotte ma ancora visibile, incubare per altri 30 minuti a quattro gradi Celsius e ripetere la centrifugazione. Una volta che il BME è stato depolimerizzato, rimuovere la soluzione di recupero cellulare lasciandosi alle spalle il pellet organoide.Lavare gli organoidi con 10 millilitri di mezzi basali mescolando con inversione. Centrifugare a 200 volte g per cinque minuti, rimuovere il supernatante e posizionare il tubo con il pellet organoide sul ghiaccio per almeno cinque minuti. Facoltativamente, se si desidera una preparazione a singola cella, aggiungere tre millilitri di tripina integrati con 30 microlitri di soluzione DNAsi I agli organoidi.Incubare questa reazione enzimatica a 37 gradi Celsius con una leggera miscelazione dell'inversione ogni due minuti per un massimo di 10 minuti. Utilizzare un microscopio Brightfield per monitorare e confermare che la dissociazione a singola cella ha esito positivo. Per fermare la reazione enzimatica, aggiungere 10 millilitri di mezzi basali ghiacciati freddi e girare verso il basso a 200 volte g per cinque minuti.Quindi rimuovere il supernatante. Lavare le cellule con 10 millilitri di mezzi basali mescolando con un'inversione delicata. Centrifugare di nuovo a 200 volte g per cinque minuti.Rimuovere il supernatante e ripetere nuovamente questo processo di lavaggio e centrifugazione. Posizionare il tubo con il pellet di cella sul ghiaccio per almeno cinque minuti. Successivamente, aggiungere bme ghiacciato al pellet cellulare e utilizzare una pipetta P200 per mescolare delicatamente la soluzione fino a quando non è omogenea.Quindi posizionare la punta della pipetta vicino al fondo del tubo e pipettare su e giù almeno da cinque a 10 volte per rompere meccanicamente gli organoidi. Utilizzare una pipetta P200 per individuare una cupola da 100 microliter al centro di un pozzo di una piastra pre-riscaldata da 12 pozzetto. Ripetere fino a quando tutta la soluzione BME non viene erosa.Quindi trasferire con cura la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per consentire al gel BME di solidificarsi. Dopo 10 minuti, recuperare la piastra e aggiungere un millilitro di supporto completo organoide pre-riscaldato ad ogni pozzo. Le colture organoidi sono tipicamente passo su sette-10 giorni a seconda della densità e proliferazione della coltura.Se necessario, ricaricare le colture con 200 microlitri di supporti completi organoidi preri riscaldati ogni cinque giorni per compensare l'esaurimento e l'evaporazione del fattore di crescita. Dopo aver isolato singole cellule dagli organoidi, rimorsi le singole cellule in un millilitro di mezzi completi organoidi umani. Utilizzare quindi un contatore di celle automatico per contare le celle assicurandosi di registrare la vitalità della cella.Calcolare il numero totale di cellule e cellule vitali presenti nella sospensione di un millilitro. Quindi rimuovere il volume equivalente a 400.000 celle e trasferirlo in un nuovo tubo. Aggiungere supporti completi organoidi a questo tubo per portare il volume a 7,2 millilitri.Per i test terapeutici, preparare le cellule per la placcatura mescolando 800 microlitri di BME con 7,2 millilitri di mezzi completi organoidi contenenti le cellule sul ghiaccio. Trasferire la miscela in un serbatoio tenuto sul ghiaccio e utilizzare una pipetta a 12 canali per placcare 20 microlitri di questa miscela in ogni pozzo di una piastra da 384 porri con conseguente placcazione di circa 1.000 celle per pozzo. Quindi girare il piatto a 100 volte g per un minuto in un secchio oscillante e posizionare il piatto in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius.Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio Brightfield per verificare la presenza di organoidi. In questo studio, l'organoide PDAC derivato dal paziente è isolato, espanso e caratterizzato. Per illustrare le sfide associate all'isolamento degli organoidi dal PDAC, viene stabilita una coltura organoide rappresentativa derivata dal paziente da un piccolo campione di tumore ipocellulare.Gli organoidi sono autorizzati a crescere più grandi nell'arco di due settimane e vengono passaggi secondo il protocollo per stabilire una cultura più robusta. Le singole cellule di un organoide PDAC rappresentativo stabilito e in rapida crescita sono quindi pronte a dimostrare l'esito del protocollo di farmacotipizzazione. 1.000 cellule vitali sono placcate in ogni pozzo e possono riprendersi per un periodo di 24 ore prima che gli agenti chemioterapici citotossici siano dosati.Un saggio di dose 9.0 viene eseguito in triplice copia a partire da una bassa dose di 100 picomolare e terminando con una dose elevata di due micromolari. Dopo un trattamento di cinque giorni, vengono scattate foto rappresentative per i pozzi trattati con il veicolo e con l'alta dose di ogni agente chemioterapico. Immediatamente dopo aver scattato le foto, la vitalità cellulare viene valutata utilizzando il reagente di vitalità cellulare luminescente e tracciata utilizzando il software di grafica.Gli organoidi derivati dal paziente possono avere morfologie eterogenee. Pertanto, è importante ottimizzare le dissociazioni enzimatiche per ogni singola cultura. L'analisi a valle dei modelli derivati dal paziente di solito comporta il sequenziamento di nuova generazione del DNA e dell'RNA.Se possibile, convalidare le caratteristiche molecolari dei modelli utilizzando campioni di tessuto primario. Le colture organoidi individualizzate aprono la possibilità di approcci di medicina personalizzati per i pazienti con cancro al pancreas. Ricorda che le sostanze chimiche pericolose come il fenolo-cloroformio e gli agenti chemioterapici devono essere maneggiate con DPI e attrezzature di sicurezza adeguati.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Che imita e manipolare Metaplasia acinoso--Ductal pancreatico nella coltura cellulare 3-dimensionale

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modello Xenotrapianto eterogeneo derivato dal paziente del cancro pancreatico utilizzando larve di pesce zebra come ospiti per la valutazione comparativa del farmaco

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

L'istituzione e l'utilizzo di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di metastasi del sistema nervoso centrale

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Istituzione di xenotrapianti derivati da pazienti zebrafish da cancro del pancreas per test di chemiosensibilità

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Definizione e caratterizzazione di modelli di xenotrapianto derivati dal paziente di carcinoma anaplastico della tiroide e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo