Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
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UCサンディエゴムーアズがんセンターバイオリポジトリと組織技術共有リソース、ローリー研究所のメンバー、および外科腫瘍学部門のUCサンディエゴ外科部門のサポートに感謝しています。AMLは、NIH CA155620、SU2C CRUKルストガルテン財団膵臓がんドリームチーム賞(SU2C-AACR-DT-20-16)、膵臓癌を治すための基金への寄付者によって寛大にサポートされています。

研究用のすべてのヒト組織収集は、当社の内部審査委員会(IRB)によって審査され、承認されました。以下のプロトコルのすべては、哺乳動物組織培養実験室環境において無菌条件下で行われる。
1. メディアの準備
<ol><li>条件付きメディアの準備。 注:ヒト膵臓オルガノイドメディアは、豊富な成長因子と栄養素だけでなく、オルガノイド拡張のための十分な成長刺激?...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

ここでは、患者由来PDACオルガノイドを分離、拡張、特徴付けするための現在のプロトコルを提示する。オルガノイド培養の確立に関する現在の成功率は70%を超えています。したがって、これらの方法はまだ完成されておらず、時間の経過とともに改善と進化が期待されています。PDACは腫瘍性細胞性が低いため、サンプルサイズに対して重要な考慮事項を考慮する必要があります。その結果?...

膵管腺癌(PDAC)は、ほとんどの患者における後期診断、有効な治療法の欠如、および結果として10%1未満のままである低5年全体生存率を特徴とする致死性疾患である。患者のわずか20%が治癒外科的介入に適した局所疾患と診断される2、3.残りの患者は、典型的には、患者4、5の少数派に有効である化学療法剤の組み合わせで治療される。これらの差し迫った臨床ニーズに対応するために、研究者は早期発見戦略とより効果的な治療法の開発に積極的に取り組んでいます。重要な発見の臨床翻訳を加速するために、科学者は遺伝子操作されたマウスモデル、患者由来の異種移植片、単層細胞ライン、および、最近ではオルガノイドモデル6を採用している。
未変形前駆細胞の増殖を刺激する増殖因子およびWnt-リガンド豊富な条件を用いた三次元上皮オルガノイド培養は、まずマウス腸7について説明し、正常ヒト膵臓組織8に迅速に適応した。正常な乳管組織に加えて、オルガノイド方法論は、ヒトPDAC8の単離、膨張、および研究を可能にする。重要なことに、この方法は、外科検体からのオルガノイドの確立、ならびに細かいおよびコア針生検を支持し、研究者が疾患9、10のすべての段階を研究することを可能にする。興味深いことに、患者由来のオルガノイドは、よく記述された腫瘍転写サブタイプを要約し、精密医療プラットフォーム9、11の開発を可能にし得る。
PDACのための現在のオルガノイドプロトコルは、化学ナイーブ患者9からの患者サンプルの70%以上の正常な拡張を可能にする。ここでは、患者由来のPDACオルガノイドを単離、拡張、および特徴付けるために、当社の研究室で採用されている標準的な方法を提示します。他のPDACオルガノイド方法論は、12、13に記載されているが、これらの方法の比較は徹底的に行われていない。この技術は比較的新しく、急速に進歩しているので、これらのプロトコルは進化し続け、改善されることを期待しています。しかし、組織の取り扱いとオルガノイド培養の原理は引き続き有用であろう。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

膵管腺癌(PDAC)は、最も致死的な悪性腫瘍の一つである。近年、この疾患の3次元(3D)モデリングを可能にする次世代オルガノイド培養法が挙げられている。患者由来オルガノイド(PDO)モデルは、外科検体および小さな生検の両方から単離し、培養中に急速に形成することができる。重要なことに、オルガノイドモデルは、患者の腫瘍で検出された病原性遺伝子変化を保持し、患者の治療応答を予測するので、翻訳研究を可能にする。ここでは、3D、マトリックス埋め込み、オルガノイドモデルを研究するために組織培養ワークフローを適応するための包括的なプロトコルを提供します。原発性PDACオルガノイドの分離と伝播に関する方法と考慮事項について詳しく説明します。さらに、実験室でオルガノイドメディアがどのように調製され、品質を制御しているかを説明します。最後に、核酸(DNAおよびRNA)の単離、薬物検査などのオルガノイドモデルの下流特性評価のためのアッセイについて説明します。重要なことは、研究室でオルガノイド方法論を実装するための重要な考慮事項を提供することです。

PDACからのオルガノイドの分離に関連する課題を例示するために、小さな低細胞腫瘍サンプルから患者由来オルガノイド培養物の確立を示す。最初のめっき後、図1に示すように、ウェルごとに少数のオルガノイドしか見えなかった。オルガノイドは、2週間のスパンにわたって大きく成長させられ、より堅牢な文化を確立するために、我々のプロトコルに従って通過させ?...

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Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

膵管腺癌の患者由来オルガノイド培養は、高忠実度で上皮腫瘍細胞コンパートメントを表す急速に確立された3次元モデルであり、この致死性悪性腫瘍に対する翻訳研究を可能にする。ここでは、オルガノイドを確立し、伝播する方法を詳細に提供するとともに、これらのモデルを用いて関連する生物学的アッセイを行う方法を提供する。

患者由来膵管腺癌オルガノイドモデルの単離と特徴付け

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

患者由来のオルガノイドモデルは、この疾患の遺伝的および表現型異質性を反映した膵臓癌を研究するための強力かつ迅速なツールであるため、この方法は重要である。この技術の主な利点は、オルガノイドは限られた量の癌から高い成功率で単離することができ、下流の分析のためにインビトロで急速に拡大することができるということです。細胞毒性薬に対するオルガノイドの反応を研究することは、腫瘍が治療に耐性になる理由を理解し、より効果的な治療戦略を定義するのに役立つかもしれません。この手順を開始するには、調製した12ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。無菌セルリフターを使用して、底面を削らないようにしながら、完全な媒体に浮遊するように、地下膜エキスドームをそっと持ち上げます。P1000ピペットを使用して、BMEドームとメディアを慎重に15ミリリットルの円錐チューブに移します。オルガノイド含有ウェルごとにこのステップを繰り返します。1ミリリットルの冷たい基底培地で収穫したウェルをそっと洗い、オルガノイドを含むチューブに移します。溶液とオルガノイドをP1000ピペットで十分に混合し、200倍gで5分間スピンダウンします。懸濁液中のオルガノイドとオルガノイドペレットを含むBMEの層がチューブの下部に現れます。上清を慎重に除去し、BMEとオルガノイド層の損失を避けてください。チューブを氷の上に置きます。チューブに氷冷細胞回収液の10ミリリットルを追加し、完全に反転によって混合.反転によって3分ごとに混合しながら、氷の上で30分間インキュベートします。この後、200回gで5分間遠心分離する。BME層がなくなっている間、オルガノイドペレットは明らかであるべきです。BME層のサイズは小さくても目に見える場合は、摂氏4度でさらに30分間インキュベートし、遠心分離を繰り返します。BMEを脱重化したら、オルガノイドペレットを残したまま細胞回収液を除去する。オルガノイドを10ミリリットルの基底培地で洗浄し、反転と混合します。200回gで5分間遠心分離機を取り出し、オルガノイドペレットを氷の上に5分間置きます。必要に応じて、単一の細胞製剤が望ましい場合、30マイクロリットルのDNAse I溶液を添加したトリプシンをオルガノイドに加える。この酵素反応を摂氏37度でインキュベートし、2分ごとに最大10分間穏やかな反転を混合します。ブライトフィールド顕微鏡を使用して、単一細胞の解離が成功したことを監視し、確認します。酵素反応を止めるには、氷冷基底培地を10ミリリットル加え、200倍gで5分間スピンダウンします。その後、上清を取り除く。穏やかな反転と混合することにより、基底培地の10ミリリットルで細胞を洗浄します。5分間200回gで再び遠心分離機。上清を取り除き、この洗浄と遠心分離プロセスをもう一度繰り返します。細胞ペレットを入れたチューブを氷の上に少なくとも5分間置きます。この後、細胞ペレットに氷冷BMEを加え、P200ピペットを使用して均質になるまで溶液を穏やかに混ぜます。その後、管の底に近いピペットの先端を置き、ピペットを少なくとも5〜10回上下に置き、オルガノイドを機械的に分解します。P200ピペットを使用して、事前に温めた12ウェルプレートの井戸の中央に100マイクロリットルのドームを見つけます。すべてのBMEソリューションが分配されるまで繰り返します。その後、慎重にBMEゲルを固めるために摂氏37度のインキュベーターにプレートを移します。10分後、プレートを取り出し、各ウェルに予温されたオルガノイド完全な培地を1ミリリットル加えます。オルガノイド培養は、典型的には、培養密度および増殖に応じて7〜10日にわたって通過する。必要に応じて、成長因子の枯渇と蒸発を補うために、5日ごとに200マイクロリットルの予熱されたオルガノイド完全な培地で培養をトップアップします。オルガノイドから単一細胞を単離した後、ヒトオルガノイド完全培地の1ミリリットルで単一細胞を再懸濁させる。次に、自動セル カウンタを使用してセルの生存率を記録するようにセルをカウントします。1ミリリットルの懸濁液に存在する細胞および生存細胞の総数を計算する。その後、400,000個の細胞に相当する体積を取り除き、新しいチューブに移します。このチューブにオルガノイドの完全な培地を加え、体積を7.2ミリリットルまで引き上げる。治療試験のために、800マイクロリットルのBMEと7.2ミリリットルのオルガノイド完全培地を氷上に含む完全な培地と混合して、めっき用の細胞を調製する。氷の上に保管されている貯水池に混合物を移し、12チャネルのピペットを使用して、この混合物の20マイクロリットルを384ウェルプレートの各ウェルにプレートし、約1,000個の細胞がウェルごとにメッキされます。その後、スイングバケツで100倍gでプレートを回転させ、プレートを摂氏37度の組織培養インキュベーターに入れる。24時間後、ブライトフィールド顕微鏡を使用してオルガノイドの存在を確認します。本研究では、患者由来のPDACオルガノイドが単離され、拡張され、特徴付けられる。PDACからのオルガノイドの単離に関連する課題を説明するために、代表的な患者由来のオルガノイド培養は、小さな低細胞腫瘍サンプルから確立される。オルガノイドは、2週間にわたって大きく成長することが許され、より堅牢な文化を確立するためのプロトコルに従って通過される。確立され、急速に成長している代表的なPDACオルガノイドからの単一細胞は、次に、薬物型変換プロトコルの結果を実証するために準備される。1,000個の生存細胞は、各ウェルでめっきされ、細胞傷害性化学療法剤が投薬される前に24時間にわたって回復することを許される。9.0用量アッセイは、100ピコモラーの低用量で始まり、2つのマイクロモルの高用量で終わる三重で行われる。5日間の治療の後、代表的な写真は、車両で治療された井戸と各化学療法剤の高用量で撮影される。写真を撮った直後に、細胞生存率を発光細胞生存率試薬を用いて評価し、グラフ化ソフトウェアを用いてプロットする。患者由来のオルガノイドは、異種形態を有することができる。したがって、すべての単一のカルチャに対して酵素的解離を最適化することが重要です。患者由来モデルの下流解析は、通常、DNAおよびRNAの次世代シーケンシングを伴う。可能であれば、一次組織サンプルを用いてモデルの分子特性を検証する。個別化されたオルガノイド培養は、膵臓癌患者のための個別化医療アプローチの可能性を開きます。フェノールクロロホルムや化学療法剤などの有害化学物質は、適切なPPEおよび安全装置で取り扱う必要があることを覚えておいてください。

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同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

真似をして 3次元細胞培養の膵腺房の上皮化生を操作します。

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

比較薬評価の宿主としてゼブラフィッシュ幼虫を用いた膵臓癌の患者由来異種異種移植片モデル

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

膵臓腺癌の腫瘍微小環境を調べるための近位液の分離

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

中枢神経系転移の患者由来異種移植モデルの確立と利用

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

化学感受性試験のためのゼブラフィッシュ患者由来膵臓癌異種移植片の樹立

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...