Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

우리는 UC 샌디에고 무어 암 센터 생물 저장소 및 조직 기술 공유 자원의 지원에 감사드립니다, 로위 실험실의 구성원, 수술의 UC 샌디에고 부서, 외과 종양학의 부문. AML은 NIH CA155620, SU2C CRUK 루스트가르텐 재단 췌장암 드림 팀 상(SU2C-AACR-DT-20-16)과 췌장암 치료 기금에 대한 기부자들의 후원을 받고 있습니다.

연구 사용을 위한 모든 인간 조직 수집은 내부 검토 위원회(IRB)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 다음 의정서는 모두 포유류 조직 배양 실험실 환경에서 무균 조건하에서 수행된다.
1. 미디어 준비
<ol><li>컨디셔닝된 미디어 준비. 참고: 인간의 췌 장 오르가노이드 매체는 유기 체 확장에 대 한 충분 한 성장 자극을 제공 하기 위해 풍부한 성장 인자 및 영양소 뿐만 아니라 ?...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

여기에서는 환자 유래 PDAC 오르가노이드를 분리, 확장 및 특성화하기 위한 현재 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 문화를 확립하는 우리의 현재 성공률은 70 % 이상입니다; 따라서 이러한 방법은 아직 완성되지 않았으며 시간이 지남에 따라 개선되고 진화할 것으로 예상됩니다. PDAC는 낮은 신생물 세포성을 가지고 있기 때문에 샘플 크기에 중요한 고려 사항을 주어야합니다. 따라서, 작은 견본...

췌장 덕트 선암(PDAC)은 대부분의 환자에서 늦은 진단, 효과적인 치료법의 부족, 그리고 10% 미만으로 남아 있는 5년 전체 생존율이 낮은 치명적인질환이다. 환자의 20%만이 치료외과적 개입에 적합한 국부성 질환으로 진단된다2,3. 나머지 환자는 전형적으로 소수의 환자4,5에서효과적인 화학치료제의 조합으로 치료된다. 이러한 긴급한 임상 적 요구를 해결하기 위해 연구자들은 조기 발견 전략과 보다 효과적인 치료법 개발에 적극적으로 노력하고 있습니다. 중요한 발견의 임상 번역을 가속화하기 위하여는, 과학자는 유전으로 조작한 마우스 모형, 참을성 있는 파생된 이종이식, 단층 세포 선 및, 가장 최근에, organoid 모형6를채택하고 있습니다.
변형되지 않은 전구세포의 증식을 자극하는 성장인자 및 Wnt-리간드를 이용한 3차원 상피 오르가노이드 배양은 마우스장(7)에 대해 최초로 기술되었고 정상 인간 췌장 조직에 신속하게 적응시켰다8. 일반적인 덕트 조직 이외에, organoid 방법론은 인간 PDAC8의격리, 확장 및 연구를 허용합니다. 중요한 것은, 이 방법은 수술 표본에서 오르가노이드의 확립뿐만 아니라 미세 및 코어 바늘 생검을 지원하여 연구원이 질병의 모든 단계를 연구 할 수있도록9,10. 흥미롭게도, 환자 유래 오르가노이드는 잘 기재된 종양 전사체 아류형을 재입증하고 정밀 의학 플랫폼9,11의개발을 가능하게 할 수 있다.
PDAC를 위한 현재 organoid 프로토콜은 화학 순진한 환자에게서 참을성 있는 견본의 70% 이상 의 성공적인 확장을 가능하게합니다 9. 여기에서 우리는 환자 유래 PDAC 오르가노이드를 분리, 확장 및 특성화하기 위해 실험실에서 사용하는 표준 방법을 제시합니다. 다른 PDAC 조직적 방법론은12,13에 기술되었지만 이들 방법의 비교는 철저히 수행되지 않았다. 이 기술은 비교적 새롭고 빠르게 발전하기 때문에 이러한 프로토콜은 계속 진화하고 개선될 것으로 기대합니다. 그러나 조직 취급 및 오르가노이드 문화의 원리는 계속 유용할 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

췌장 덕트 선암 (PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 사이에 있습니다. 최근에는 이 질병의 3차원(3D) 모델링을 가능하게 하는 차세대 오르가노이드 배양 방법이 기술되고 있다. 환자 유래 오르가노이드(PDO) 모델은 수술 표본뿐만 아니라 작은 생검에서 분리될 수 있으며 배양에서 빠르게 형성될 수 있다. 중요한 것은, organoid 모형은 환자의 종양에서 검출된 병원성 유전 변경을 보존하고 환자의 처리 반응의 예측, 따라서 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기서, 우리는 3D, 매트릭스 임베디드, 오르가노이드 모델을 연구하기 위해 조직 배양 워크플로우를 적응시키기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 우리는 1 차적인 PDAC 오르가노이드를 격리하고 전파하기 위한 방법 그리고 고려사항을 상세히 설명합니다. 또한 맞춤형 오르가노이드 미디어가 실험실에서 어떻게 준비되고 품질이 조절되는지 설명합니다. 마지막으로, 우리는 핵산 (DNA와 RNA)의 격리와 같은 오르가노이드 모형의 하류 특성화를 위한 실험 (DNA와 RNA), 및 약 시험을 기술합니다. 중요한 것은 우리는 연구 실험실에서 유기적 방법론을 구현하기위한 중요한 고려 사항을 제공합니다.

PDAC에서 오르가노이드를 분리하는 것과 관련된 문제를 설명하기 위해, 우리는 작은 세포내 종양 샘플로부터 환자 유래 오르가노이드 배양물의 확립을 보여준다. 초기 도금 후 그림 1과같이 웰당 몇 개의 오르가노이드만 보였습니다. 오가노이드는 2주 동안 더 크게 성장할 수 있었고, 초기 및 후기 통로 1의 대표적인 사진에 나타난 바와 같이 보다 견고한 문화를 확립하기 위?...

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Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

췌장 덕트 선암의 환자 유래 오르가노이드 배양은 높은 충실도를 가진 상피 종양 세포 구획을 나타내는 급속하게 확립된 3차원 모형, 이 치명적인 악성에 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기에서, 우리는 이 모형을 사용하여 관련 생물학 생물학 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 을 능력을 발휘하기 위하여 오르가노이드를 설치하고 전파하기 위하여 상세한 방법을 제공합니다.

환자 유래 췌장 선암 조직형 모델의 격리 및 특성 분석

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

환자 유래 오르가노이드 모델은 이 질병의 유전적 및 현상이 있는 이질성을 반영하기 때문에 췌장암을 연구할 수 있는 강력하고 신속한 도구이기 때문에 이 방법이 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 오르가노이드가 제한된 양의 암에서 높은 성공률로 격리 될 수 있으며 다운스트림 분석을위한 시험관 에서 빠르게 확장 될 수 있다는 것입니다. 세포 독성 약물에 대한 오르가노이드의 반응을 연구하면 종양이 치료에 내성이 되는 이유를 이해하고 보다 효과적인 치료 전략을 정의하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 인큐베이터에서 준비된 12웰 플레이트를 회수합니다. 멸균 셀 리프터를 사용하면 지하 멤브레인 추출물 돔을 부드럽게 들어 올려 우물 바닥을 긁지 않도록하면서 전체 매체에 떠 있습니다. P1000 파이펫을 사용하여 BME 돔과 미디어를 15밀리리터 원피스 튜브로 조심스럽게 이송합니다.모든 오르가노이드 함유에 대해이 단계를 잘 반복하십시오. 차가운 기저 질의 1 밀리리터로 수확된 각 우물을 부드럽게 씻고 이 세척을 오르가노이드가 함유된 튜브로 옮춥춥시다. 용액과 오르가노이드를 P1000 파이펫과 철저히 혼합하고 5분 동안 200배 g로 회전합니다.현탁액및 오르가노이드 펠릿에 오르가노이드를 함유하는 BME층이 튜브 의 바닥에 나타납니다. BME 및 오르가노이드 층의 손실을 피하기 위해 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.튜브에 얼음 차가운 세포 복구 용액 10 밀리리터를 추가하고 반전으로 철저히 섞습니다. 반전으로 3분간격으로 섞으면서 30분 간 얼음에 배양합니다. 그 후 원심분리기는 5분간 200배 g로 합니다.BME 층이 사라져야하는 동안 오르가노이드 펠릿은 명백해야합니다. BME 층의 크기가 감소하지만 여전히 보이는 경우 섭씨 4도에서 추가로 30 분 동안 배양하고 원심 분리를 반복하십시오. BME가 폴리머화되면, 오르가노이드 펠릿을 남기면서 세포 회수 용액을 제거한다.오르가노이드를 10 밀리리터의 기초 매체로 씻어 반전과 혼합하여 씻으세요. 원심분리기는 5분 동안 200배 g로, 상류체를 제거하고, 적어도 5분 동안 얼음 위에 오르가노이드 펠릿을 장착한 튜브를 놓습니다. 선택적으로, 단일 세포 준비를 원하는 경우에, 오르가노이드에 DNAse I 용액의 30 마이크로 리터로 보충 트립신의 3 밀리리터를 추가합니다.37도에서 이 효소 반응을 최대 10분 동안 2분간격으로 부드럽게 반전할 수 있습니다. 브라이트필드 현미경을 사용하여 단일 세포 해리가 성공적임을 모니터링하고 확인합니다. 효소 반응을 막으려면 얼음 차가운 기저 미디어의 10 밀리리터를 추가하고 5 분 동안 200 배 g에서 회전하십시오.그런 다음 상체를 제거합니다. 부드러운 반전과 혼합하여 기저 미디어의 10 밀리리터로 세포를 씻어. 원심 분리기는 5 분 동안 200 배 g에서 다시 합니다.상체를 제거하고이 세척 및 원심 분리 과정을 다시 한 번 반복합니다. 적어도 5 분 동안 얼음에 세포 펠릿튜브를 놓습니다. 그런 다음, 세포 펠릿에 얼음 차가운 BME를 추가하고 P200 파이펫을 사용하여 균일할 때까지 용액을 부드럽게 혼합합니다.그런 다음 파이펫 끝을 튜브 의 바닥에 가깝게 놓고 파이펫을 적어도 5~10회 위아래로 올려 놓고 기계적으로 오르가노이드를 분해합니다. P200 파이펫을 사용하여 미리 데워진 12웰 플레이트의 중앙에 있는 100 마이크로리터 돔을 발견하십시오. 모든 BME 솔루션이 분배될 때까지 반복합니다.그런 다음 조심스럽게 BME 젤이 고화 할 수 있도록 섭씨 37도에서 인큐베이터로 플레이트를 전송합니다. 10분 후, 접시를 회수하고 미리 데워진 오르가노이드 완성 용지 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 오르가노이드 배양은 일반적으로 배양 밀도 및 증식에 따라 7~10일 이상 통과됩니다.필요한 경우, 성장 인자 고갈 및 증발을 보상하기 위해 5 일마다 사전 따뜻하게 된 오르가노이드 완성 매체의 200 마이크로 리터로 문화를 보충하십시오. 오르가노이드에서 단일 세포를 격리 한 후, 인간 오르가노이드 완성 매체의 1 밀리리터에서 단일 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀 생존 가능성을 기록하는 셀을 계산합니다.1 밀리리터 서스펜션에 존재하는 총 세포 수와 실행 가능한 세포를 계산합니다. 그런 다음 400, 000 셀에 해당하는 부피를 제거하고 새로운 튜브로 옮김합니다. 이 튜브에 오르가노이드 완전 미디어를 추가하여 최대 7.2 밀리리터의 볼륨을 가져옵니다.치료 테스트를 위해, 얼음에 세포를 포함하는 오르가노이드 완전 매체의 7.2 밀리리터와 BME의 800 마이크로리터를 혼합하여 도금세포를 준비합니다. 혼합물을 얼음 위에 보관하는 저수지로 옮기고 12채널 파이펫을 사용하여 이 혼합물의 20 마이크로리터를 384웰 플레이트의 각 웰로 플레이트하여 웰당 약 1, 000개의 세포가 도금된다. 그런 다음 그네 버킷에서 1 분 동안 100 배 g에서 접시를 회전시키고 접시를 섭씨 37도에서 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.24 시간 후에, 오르가노이드의 존재를 확인하기 위하여 브라이트 필드 현미경을 이용합니다. 이 연구에서는, 환자 유래 PDAC 오르간노이드는 고립되고, 확장되고, 특징지입니다. PDAC에서 유기노이드를 분리하는 것과 관련된 과제를 설명하기 위해, 대표적인 환자 유래 오르가노이드 배양은 작은 저세포 종양 샘플에서 확립된다.오르가노이드는 2 주 동안 더 크게 성장할 수 있으며 프로토콜에 따라 통과되어 보다 강력한 문화를 확립합니다. 확립되고 빠르게 성장하는 대표 PDAC 오르간노이드의 단일 세포는 약전 프로토콜의 결과를 입증할 준비가 되어 있습니다. 1, 000의 실행 가능한 세포는 각 우물에서 도금되고 세포 독성 화학 요법 에이전트가 투약되기 전에 24 시간 기간 동안 회복할 수 있습니다.A 9.0 용량 분석의 낮은 복용량으로 시작 하 여 triplicate에서 수행 100 피코몰러 와 두 개의 마이크로 몰러의 높은 복용량으로 끝나는. 5 일 치료 후, 대표 사진은 차량과 각 화학 요법 에이전트의 높은 용량으로 치료 우물에 대한 촬영됩니다. 사진을 찍은 직후, 세포 생존가능성은 발광 세포 생존 능력 시약을 사용하여 평가되고 그래프 소프트웨어를 사용하여 플롯됩니다.환자 유래 오르가노이드는 이질적인 형태를 가질 수 있습니다. 따라서 모든 단일 문화에 대한 효소 적 해리를 최적화하는 것이 중요합니다. 환자 유래 모델의 다운스트림 분석은 일반적으로 DNA와 RNA의 차세대 염기서열분석을 수반한다.가능하면 1차 조직 샘플을 사용하여 모델의 분자 특성을 검증합니다. 개별화된 오르가노이드 배양은 췌장암 환자를 위한 개인화된 약 접근을 위한 가능성을 열어주습니다. 페놀 클로로폼 및 화학요법 제과 같은 유해 화학 물질은 적절한 PPE 및 안전 장비로 처리되어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

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연구

암 연구학

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Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

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