Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
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Agradecemos el apoyo del UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, miembros del laboratorio Lowy, y el Departamento de Cirugía de UC San Diego, División de Oncología Quirúrgica. AML cuenta con el generoso apoyo de NIH CA155620, un su2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16) y donantes al Fondo para Curar el Cáncer De Páncreas.

Toda la recolección de tejido humano para uso de investigación fue revisada y aprobada por nuestra Junta de Revisión Interna (IRB). Todos los siguientes protocolos se realizan en condiciones asépticas en un entorno de laboratorio de cultivo de tejido de mamíferos.
1. Preparación de medios
<ol><li>Preparación de medios condicionados. NOTA: El medio organoide pancreático humano requiere abundantes factores de crecimiento y nutrientes, así como suplementos de medios acondicionados p...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

Aquí, presentamos protocolos actuales para aislar, expandir y caracterizar organoides PDAC derivados del paciente. Nuestra tasa de éxito actual de establecer el cultivo organoide es de más del 70%; por lo tanto, estos métodos aún no se han perfeccionado y se espera que mejoren y evolucionen con el tiempo. Se debe tener en cuenta el tamaño de la muestra, ya que PDAC tiene una celularidad neoplásica baja. En consecuencia, los especímenes pequeños contendrán pocas células tumorales, y sólo generarán un puñado ...

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es una enfermedad letal caracterizada por un diagnóstico tardío en la mayoría de los pacientes, una falta de terapias eficaces y una tasa de supervivencia global de 5 años resultante que permanece inferior al 10%1. Sólo el 20% de los pacientes son diagnosticados con una enfermedad localizada adecuada para la intervención quirúrgica curativa2,3. Los pacientes restantes son típicamente tratados con una combinación de agentes quimioterápicos que son eficaces en una minoría de pacientes4,5. Para hacer frente a estas necesidades clínicas apremiantes, los investigadores están trabajando activamente en estrategias de detección temprana y el desarrollo de terapias más eficaces. Para acelerar la traducción clínica de descubrimientos importantes, los científicos están empleando modelos de ratón genéticamente diseñados, xenoinjertos derivados del paciente, líneas de células monocapa y, más recientemente, modelos organoides6.
Cultivo organoide epitelial tridimensional utilizando factor de crecimiento y condiciones ricas en Wnt-ligand para estimular la proliferación de células progenitoras no transformadas se describieron por primera vez para el intestino del ratón7 y se adaptaron rápidamente al tejido pancreático humano normal8. Además del tejido ductal normal, la metodología organoidea permite el aislamiento, expansión y estudio de PDAC8humano. Es importante destacar que el método apoya el establecimiento de organoides a partir de muestras quirúrgicas, así como biopsias finas y de agujas de núcleo, permitiendo a los investigadores estudiar todas las etapas de la enfermedad9,10. Curiosamente, los organoides derivados del paciente recapitulan subtipos transcriptómicos tumorales bien descritos y pueden permitir el desarrollo de plataformas de medicina de precisión9,11.
Los protocolos organoides actuales para PDAC permiten la expansión exitosa de más del 70% de las muestras de pacientes de pacientes quimio-nave9. Aquí presentamos los métodos estándar empleados por nuestro laboratorio para aislar, expandir y caracterizar los organoides PDAC derivados del paciente. Se han descrito otras metodologías de organoides de PDAC12,13, pero no se ha realizado a fondo ninguna comparación de estos métodos. Como esta tecnología es relativamente nueva y avanza rápidamente, esperamos que estos protocolos continúen evolucionando y mejorando; sin embargo, los principios del manejo de los tejidos y el cultivo organoide seguirán siendo útiles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) se encuentra entre los tumores malignos más letales. Recientemente, se han descrito métodos de cultivo organoides de próxima generación que permiten el modelado tridimensional (3D) de esta enfermedad. Los modelos de organoides (DOP) derivados del paciente pueden aislarse tanto de muestras quirúrgicas como de pequeñas biopsias y formarse rápidamente en el cultivo. Es importante destacar que los modelos organoides preservan las alteraciones genéticas patógenas detectadas en el tumor del paciente y son predictivos de la respuesta al tratamiento del paciente, permitiendo así estudios traslacionales. Aquí, proporcionamos protocolos integrales para adaptar el flujo de trabajo de cultivo de tejidos para estudiar modelos de organoides 3D, matriz incrustada. Detallamos métodos y consideraciones para aislar y propagar organoides PDAC primarios. Además, describimos cómo se preparan los medios organoides a medida y se controla la calidad en el laboratorio. Por último, describimos los ensayos para la caracterización posterior de los modelos organoides, como el aislamiento de ácidos nucleicos (ADN y ARN), y las pruebas de fármacos. Es importante destacar que proporcionamos consideraciones críticas para implementar la metodología organoide en un laboratorio de investigación.

Para ilustrar los desafíos asociados con el aislamiento de los organoides de PDAC, mostramos el establecimiento de un cultivo organoide derivado del paciente a partir de una pequeña muestra de tumor hipocelular. Después del revestimiento inicial, sólo unos pocos organoides eran visibles por pozo, como se muestra en la Figura 1. A los organoides se les permitió crecer más grandes en el lapso de 2 semanas y se pasajeron de acuerdo con nuestro protocolo para establecer una cultura más ro...

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Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Los cultivos organoides derivados del paciente de adenocarcinoma ductal pancreático son un modelo tridimensional rápidamente establecido que representa compartimentos de células tumorales epiteliales con alta fidelidad, lo que permite la investigación traslacional sobre esta malignidad letal. Aquí, proporcionamos métodos detallados para establecer y propagar organoides, así como para realizar ensayos biológicos relevantes utilizando estos modelos.

Aislamiento y caracterización de modelos de organoide de adenocarcinoma ductal pancreático derivados del paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Este método es significativo porque los modelos organoides derivados del paciente son una herramienta potente y rápida para estudiar el cáncer de páncreas, ya que reflejan la heterogeneidad genética y fenotípica de esta enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que los organoides se pueden aislar con una alta tasa de éxito de una cantidad limitada de cáncer y se pueden expandir rápidamente in vitro para el análisis posterior. El estudio de la respuesta de los organoides a los medicamentos citotóxicos puede ayudarnos a entender por qué los tumores se vuelven resistentes a la terapia y a definir estrategias de tratamiento más eficaces.Para comenzar este procedimiento, recupere la placa de 12 pozos preparada de la incubadora. Con un elevador de células estériles, levante suavemente la cúpula de extracto de membrana del sótano de manera que esté flotando en los medios completos mientras se asegura de evitar raspar la parte inferior del pozo. Con una pipeta P1000, transfiera cuidadosamente la cúpula BME y los medios a un tubo cónico de 15 mililitros.Repita este paso para cada pozo que contenga organoides. Lave suavemente cada pozo que se haya cosechado con un mililitro de medios basales fríos y transfiera este lavado al tubo que contiene los organoides. Mezclar a fondo la solución y los organoides con una pipeta P1000 y girar hacia abajo a 200 veces g durante cinco minutos.Una capa de BME que contiene organoides en suspensión y un pellet organoides aparecerá en la parte inferior del tubo. Retire cuidadosamente el sobrenadante asegurándose de evitar cualquier pérdida de la capa BME y organoidea. Coloque el tubo sobre hielo.Agregue 10 mililitros de solución de recuperación de células heladas al tubo y mezcle a fondo por inversión. Incubar sobre hielo durante 30 minutos mientras se mezcla cada tres minutos por inversión. Después de esto, centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos.El pellet organoide debe ser evidente mientras que la capa BME debe desaparecer. Si la capa BME se reduce de tamaño pero sigue siendo visible, incubar durante 30 minutos adicionales a cuatro grados centígrados y repetir la centrifugación. Una vez que el BME ha sido despolimerizado, retire la solución de recuperación celular dejando atrás el pellet organoide.Lavar los organoides con 10 mililitros de medios basales mezclando con la inversión. Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos, retire el sobrenadante y coloque el tubo con el pellet organoide sobre hielo durante al menos cinco minutos. Opcionalmente, si se desea una sola preparación celular, añadir tres mililitros de trippsina complementados con 30 microlitros de DNAse I solución a los organoides.Incubar esta reacción enzimática a 37 grados centígrados con una suave mezcla de inversión cada dos minutos durante un máximo de 10 minutos. Utilice un microscopio Brightfield para monitorear y confirmar que la disociación de una sola célula es exitosa. Para detener la reacción enzimática, agregue 10 mililitros de medios basales fríos y gire hacia abajo a 200 veces g durante cinco minutos.A continuación, retire el sobrenadante. Lavar las células con 10 mililitros de medios basales mezclando con una inversión suave. Centrifugar de nuevo a 200 veces g durante cinco minutos.Retire el sobrenadante y repita este proceso de lavado y centrifugación una vez más. Coloque el tubo con el pellet celular sobre hielo durante al menos cinco minutos. Después de esto, añadir BME helado al pellet celular y utilizar una pipeta P200 para mezclar la solución suavemente hasta que sea homogénea.A continuación, coloque la punta de la pipeta cerca de la parte inferior del tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos cinco a 10 veces para romper mecánicamente los organoides. Utilice una pipeta P200 para detectar una cúpula de 100 microlitros en el centro de un pozo de una placa precale calentada de 12 pozos. Repita el proceso hasta que se prescinda toda la solución BME.A continuación, transfiera cuidadosamente la placa a una incubadora a 37 grados Centígrados para permitir que el gel BME se solidifique. Después de 10 minutos, recupere la placa y agregue un mililitro de organoide precalentó a cada pozo. Los cultivos organoides se pasan típicamente durante siete a 10 días dependiendo de la densidad de cultivo y la proliferación.Si es necesario, recuple los cultivos con 200 microlitros de medios completos organoides precalegados cada cinco días para compensar el agotamiento y la evaporación del factor de crecimiento. Después de aislar las células individuales de los organoides, resuspendir las células individuales en un mililitro de medios completos organoides humanos. A continuación, utilice un contador de celdas automatizado para contar las celdas asegurándose de registrar la viabilidad de la celda.Calcular el número total de células y células viables presentes en la suspensión de un mililitro. Luego retire el volumen equivalente a 400.000 células y transfiételo a un tubo nuevo. Agregue medios completos organoides a este tubo para subir el volumen hasta 7,2 mililitros.Para pruebas terapéuticas, prepare las células para el enchapado mezclando 800 microlitros de BME con 7,2 mililitros de medios completos organoides que contienen las células sobre hielo. Transfiera la mezcla a un depósito mantenido sobre hielo y utilice una pipeta de 12 canales para placar 20 microlitros de esta mezcla en cada pozo de una placa de 384 pozos, lo que da como resultado aproximadamente 1.000 células que se vajillan por pozo. A continuación, gire hacia abajo la placa a 100 veces g durante un minuto en un cubo oscilante y coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejido a 37 grados centígrados.Después de 24 horas, utilice un microscopio Brightfield para comprobar la presencia de organoides. En este estudio, los organoides PDAC derivados del paciente se aíslan, expanden y caracterizan. Para ilustrar los desafíos asociados con el aislamiento de organoides de PDAC, se establece un cultivo organoide representativo derivado del paciente a partir de una pequeña muestra de tumor hipocelular.Se permite que los organoides crezcan más en el lapso de dos semanas y se pasan de acuerdo con el protocolo para establecer un cultivo más robusto. Las células individuales de un organoide PDAC representativo establecido y de rápido crecimiento se preparan para demostrar el resultado del protocolo de farmacotipado. 1.000 células viables se vajilla en cada pozo y se les permite recuperarse durante un período de 24 horas antes de que se dosifican los agentes quimioterapéuticos citotóxicos.Se realiza un ensayo de dosis de 9,0 en triplicado, comenzando con una dosis baja de 100 picomolares y terminando con una dosis alta de dos micromolares. Después de un tratamiento de cinco días, se toman fotografías representativas para los pozos tratados con el vehículo y con la dosis alta de cada agente quimioteráptico. Inmediatamente después de tomar las fotografías, la viabilidad celular se evalúa utilizando reactivo de viabilidad celular luminiscente y se traza utilizando software de gráficos.Los organoides derivados del paciente pueden tener morfologías heterogéneas. Por lo tanto, es importante optimizar las disociaciones enzimáticas para cada cultura. El análisis posterior de los modelos derivados del paciente generalmente implica la secuenciación de próxima generación del ADN y el ARN.Si es posible, valide las características moleculares de los modelos utilizando muestras de tejido primario. Los cultivos organoides individualizados abren la posibilidad de enfoques de medicina personalizada para pacientes con cáncer de páncreas. Recuerde que los productos químicos peligrosos, como el fenol-cloroformo y los agentes quimioterápticos, deben manipularse con epidémica y equipo de seguridad adecuados.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping de Orthotopic la homoplastia (Syngeneic) de Adenocarcinoma Ductal pancreática KPC primaria murinas por citometría de flujo

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Imitando y manipulando Metaplasia pancreática Acinar Ductal en cultivo celular 3-dimensional

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modelo de xenoinjerto heterogéneo derivado del paciente del cáncer de páncreas utilizando larvas de pez cebra como anfitriones para la evaluación comparativa de fármacos

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasonido-Guiado Implantación Ortotópica de Adenocarcinoma Ductal Pancreático Murino

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Aislamiento de líquidos proximales para investigar el microambiente tumoral del adenocarcinoma pancreático

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

El establecimiento y la utilización de modelos de xenoinjerto derivados del paciente de metástasis del sistema nervioso central

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Establecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra de cáncer de páncreas para pruebas de quimiosensibilidad

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Establecimiento y caracterización de modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de carcinoma anaplásico de tiroides y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello