Name: isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models
Uploaded: 2020-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

Biz UC San Diego Moores Kanser Merkezi Biyorepozitory ve Doku Teknolojisi Paylaşılan Kaynak, Lowy laboratuvar üyeleri ve UC San Diego Cerrahi Bölümü, Cerrahi Onkoloji Bölümü desteği için minnettarız. AML cömertçe NIH CA155620, bir SU2C CRUK Lustgarten Vakfı Pankreas Kanseri Dream Team Ödülü (SU2C-AACR-DT-20-16) tarafından desteklenir ve Fon Için Bağış Pankreas Kanseri Cure için.

Araştırma için tüm insan doku toplama gözden geçirildi ve İç İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı. Aşağıdaki protokollerin tümü memeli doku kültürü laboratuvar ortamında aseptik koşullarda yapılmaktadır.
1. Medya Hazırlama
<ol><li>Koşullu ortam hazırlığı. NOT: İnsan pankreas organoid medya bol büyüme faktörleri ve besin yanı sıra organoid genişleme için yeterli büyüme stimülasyonu sağlamak için şartlı medya takviyesi gerektirir. Aşağıda...

<ol>
	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentially+Curable+Pancreatic+Cancer:+American+Society+of+Clinical+Oncology+Clinical+Practice+Guideline+Update+Summary.">Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary.</a> Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).</li><li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1423+pancreaticoduodenectomies+for+pancreatic+cancer:+A+single-institution+experience.">1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).</li><li>Von Hoff, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+in+pancreatic+cancer+with+nab-paclitaxel+plus+gemcitabine.">Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine.</a> New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+versus+gemcitabine+for+metastatic+pancreatic+cancer.">FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer.</a> New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).</li><li>Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+pancreatic+cancer+with+organoids.">Modeling pancreatic cancer with organoids.</a> Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Profiling+Identifies+Common+Responders+to+Chemotherapy+in+Pancreatic+Cancer.">Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li><li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+creation+of+pancreatic+cancer+organoids+by+means+of+EUS-guided+fine-needle+biopsy+sampling+for+personalized+cancer+treatment.">Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment.</a> Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).</li><li>Seino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Pancreatic+Tumor+Organoids+Reveal+Loss+of+Stem+Cell+Niche+Factor+Dependence+during+Disease+Progression.">Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+of+Drug-Induced+Metabolism+Changes+in+Murine+and+Human+Pancreatic+Cancer+Organoids+Reveals+Heterogeneous+Drug+Response.">Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response.</a> Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).</li><li>Zhao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Reporter+Activity+Assay.">Wnt Reporter Activity Assay.</a> Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).</li><li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOLFIRINOX+or+Gemcitabine+as+Adjuvant+Therapy+for+Pancreatic+Cancer.">FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment.">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li></ol>

Burada, hasta kaynaklı PDAC organoidlerinin izole, genişletme ve karakterizasyonu için mevcut protokolleri sıyoruz. Organoid kültürü oluşturmadaki mevcut başarı oranımız %70'in üzerindedir; bu nedenle, bu yöntemler henüz mükemmel olmamıştır ve geliştirmek ve zaman içinde gelişmeye bekleniyor. PDAC düşük neoplastik hücreselliğe sahip olduğu için örnek boyutuna önemli önem verilmelidir. Sonuç olarak, küçük örnekler birkaç tümör hücresi içerecek ve sadece bir avuç organoid üretece...

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) çoğu hastada geç tanı ile karakterize ölümcül bir hastalıktır, etkili tedavilerin eksikliği, ve daha az kalır sonuç olarak düşük 5 yıllık genel sağkalım oranı 10%1. Hastaların sadece %20'si küratif cerrahi girişime uygun lokalize bir hastalık tanısı konur2,3. Kalan hastalar genellikle hastaların bir azınlık etkili olan kemoterapötik ajanların bir kombinasyonu ile tedavi edilir4,5. Bu acil klinik ihtiyaçları karşılamak için, araştırmacılar aktif erken teşhis stratejileri ve daha etkili tedavilerin geliştirilmesi üzerinde çalışıyoruz. Önemli keşiflerin klinik çevirisini hızlandırmak için, bilim adamları genetiği değiştirilmiş fare modelleri, hasta türetilen ksenogreftler, monolayer hücre hatları ve en son organoid modelleri6istihdam ediyoruz.
Üç boyutlu epitel organoid kültür büyüme faktörü ve Wnt-ligand zengin koşulları kullanarak dönüştürülmemiş progenitor hücrelerinin çoğalmasını teşvik etmek için ilk fare bağırsağı için tarif edildi7 ve hızlı bir şekilde normal insan pankreasdokusunaadapte edildi 8 . Normal duktal dokuek olarak, organoid metodoloji izolasyon, genişleme sağlar, ve insan PDAC çalışma8. Daha da önemlisi, yöntem cerrahi örneklerden organoidlerin kurulmasını destekler, yanı sıra ince ve çekirdek iğne biyopsileri, araştırmacılar hastalığın tüm aşamalarında çalışma sağlayan9,10. İlginçtir, hasta kaynaklı organoidler iyi tanımlanmış tümör transkriptomik alt tipleri recapitulate ve hassas tıp platformları geliştirilmesini sağlayabilir9,11.
PDAC için mevcut organoid protokoller kemo-naif hastalardan alınan hasta örneklerinin %70'inden fazlasının başarılı bir şekilde genişlemesini sağlar9. Burada hasta kaynaklı PDAC organoidlerini izole etmek, genişletmek ve karakterize etmek için laboratuvarımız tarafından kullanılan standart yöntemleri salıyoruz. Diğer PDAC organoid metodolojileri12,13 tanımlanmıştır ancak bu yöntemin karşılaştırması tam olarak gerçekleştirilmiştir. Bu teknoloji nispeten yeni ve hızla ilerlerken, bu protokollerin gelişmeye ve gelişmeye devam etmesini bekliyoruz; ancak doku işleme ve organoid kültür ilkeleri yararlı olmaya devam edecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plates</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml LoBind conical tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP0030122208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube Rotator and/or nutator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4588</td>
			<td>Ultra low attachment, black and optically clear</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADV DMEM</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiterGlow</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7570</td>
			<td>Luminescence cell viability reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>StemCELL Tech</td>
			<td>07930</td>
			<td>Cell Freezing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug printer</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>This is the drug printer we use in our laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-418</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I (human)</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Collagenase/hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Tech</td>
			<td>7919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Glutamine solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Wnt-3A expressing cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Tissue Storage Solution</td>
			<td>Miltenyi biotec</td>
			<td>130-100-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 pipette with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Filter Units (0.2 &#181;m)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>121-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89176-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes 10 cm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Acid Phenol solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R25001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models

Pankreas duktal adenokarsinom (PDAC) en ölümcül maligniteler arasında yer alan. Son zamanlarda bu hastalığın 3 boyutlu (3D) modellemesini sağlayan yeni nesil organoid kültür yöntemleri tanımlanmıştır. Hasta kaynaklı organoid (PDO) modelleri hem cerrahi örneklerden hem de küçük biyopsilerden izole edilebilir ve kültürde hızla oluşabilir. Daha da önemlisi, organoid modeller hastanın tümöründe saptanan patojenik genetik değişiklikleri korur ve hastanın tedavi yanıtının öngörücül olduğunu, böylece çeviri çalışmalarının sağlanmasını sağlar. Burada, doku kültürü iş akışını 3D, matris gömülü, organoid modelleri çalışmaya uyarlamak için kapsamlı protokoller salıyoruz. Primer PDAC organoidlerinin izole edilmesi ve yayılması için yöntemleri ve dikkatleri ayrıntılı olarak anlatıyoruz. Ayrıca, ısmarlama organoid ortamın nasıl hazırlandığı ve laboratuvarda kalitenin nasıl kontrol altına alınabildiğini anlatıyoruz. Son olarak, nükleik asitlerin (DNA ve RNA) izolasyonu ve ilaç testi gibi organoid modellerin aşağı karakterizasyonu için tahliller açıklıyoruz. Daha da önemlisi, bir araştırma laboratuvarında organoid metodolojinin uygulanması için kritik hususlar ı savuruyoruz.

PDAC organoidlerin izole ile ilgili zorlukları göstermek için, küçük bir hiposellüler tümör örneği bir hasta türetilmiş organoid kültür kurulması nı göstermektedir. İlk kaplamadan sonra, Şekil 1'degösterildiği gibi, her kuyuda sadece birkaç organoid görülebilir. Organoidler 2 haftalık süre içinde daha büyük büyümeye izin verildi ve daha sağlam bir kültür kurmak için protokolümüze göre geçit edildi, erken ve geç geçiş gösterildiği gibi 1 temsili re...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models at JoVE.com

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Pankreas duktal adenokarsinomun hasta kaynaklı organoid kültürleri, epitel aliskan kollektifini yüksek sadakatle temsil eden, bu öldürücü maligniteye çeviri araþtirici araþtýrýmý saýkan, hýzlýklý bir 3 boyutlu modeldir. Burada organoidlerin kurulması ve yayılması ve bu modelleri kullanarak ilgili biyolojik tahlillerin gerçekleþtirilen ayrýntýlý yöntemlerin yer alýnmasýný saýlýyor.

Hasta Kaynaklı Pankreas Duktal Adenokarsinom Organoid Modellerinin İzolasyon ve Karakterizasyonu

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Hasta kaynaklı organoid modelleri bu hastalığın genetik ve henotik heterojenliğini yansıttığı için pankreas kanserini incelemek için güçlü ve hızlı bir araç olduğu için bu yöntem önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, organoidlerin sınırlı sayıda kanserden yüksek başarı oranıyla izole edilebilen ve downstream analizi için in vitro hızla genişletilebilen olmasıdır. Organoidlerin sitotoksik ilaçlara verdiği tepkinin incelenmesi, tümörlerin neden tedaviye dirençli hale geldiğini anlamamıza ve daha etkili tedavi stratejileri tanımlamamıza yardımcı olabilir.Bu işlem başlamak için, kuvözden hazırlanan 12 kuyulu plakayı alın. Steril bir hücre kaldırıcı ile, yavaşça kuyunun alt kazıma önlemek için emin olurken tam ortamda yüzen olduğu gibi bodrum membran özü kubbe kaldırın. P1000 pipet kullanarak, BME kubbesini ve ortamı dikkatlice 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Her organoid içeren kuyu için bu adımı tekrarlayın. Bir mililitre soğuk bazal ortamla hasat edilen her kuyuyu hafifçe yıkayın ve bu yıkamayı organoidleri içeren tüpe aktarın. Çözeltiyi ve organoidleri P1000 pipetle iyice karıştırın ve 200 kez g'de beş dakika boyunca aşağı doğru döndürün.Süspansiyon içinde organoidler ve bir organoid pelet içeren BME tabakası tüpün alt kısmında görünür. BME ve organoid tabakakaybını önlemek için supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Tüpü buza yerleştirin.Tüpe 10 mililitre buz gibi hücre kurtarma çözeltisi ekleyin ve ters çevrilerek iyice karıştırın. Her üç dakikada bir inversiyon la karıştırırken 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yat. Bundan sonra, santrifüj 200 kez g beş dakika.BME tabakası gitmiş olmalıdır ise organoid pelet belirgin olmalıdır. BME tabakası boyutu azalmış ama hala görünür ise, dört santigrat derece ek bir 30 dakika kuluçka ve santrifüj tekrarlayın. BME depolimerize edildikten sonra, organoid pelet geride bırakarak hücre kurtarma çözeltisi kaldırın.Organoidleri 10 mililitre bazal ortamla yıkayın. Beş dakika boyunca 200 kez g santrifüj, supernatant çıkarın ve en az beş dakika buz üzerinde organoid pelet ile tüp yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, tek bir hücre hazırlığı isteniyorsa, organoidler için 30 mikrolitre DNaase I çözeltisi ile birlikte üç mililitre tripsin ekleyin.Bu enzimatik reaksiyonu 37 santigrat derecede, nazik inversiyon 10 dakikaya kadar her iki dakikada bir karıştırarak kuluçkaya yatırın. Tek hücreli dissosilasyonun başarılı olduğunu izlemek ve onaylamak için Brightfield mikroskobu kullanın. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için, 10 mililitre buz gibi bazal ortam ekleyin ve beş dakika boyunca 200 kez g'de aşağı doğru döndürün.Sonra supernatant çıkarın. Hücreleri 10 mililitre bazal ortamla yıkayın. Santrifüj tekrar 200 kez g beş dakika için.Supernatant çıkarın ve bu yıkama ve santrifüj işlemi bir kez daha tekrarlayın. En az beş dakika boyunca buz üzerinde hücre pelet ile tüp yerleştirin. Bundan sonra, hücre peletine buz gibi BME ekleyin ve çözeltiyi homojen olana kadar hafifçe karıştırmak için P200 pipetkullanın.Daha sonra pipetin ucunu tüpün dibine yakın bir yere yerleştirin ve pipetleri en az 5-10 kez yukarı ve aşağı yerleştirin ve organoidleri mekanik olarak parçalayın. Önceden ısıtılmış 12 kuyulu bir plakanın ortasında 100 mikrolitrelik bir kubbeyi tespit etmek için P200 pipetkullanın. Tüm BME çözeltisi dağıtılana kadar tekrarlayın.Daha sonra plakayı 37 santigrat dereceden bir kuvöze dikkatlice aktarın ve BME jelinin katılaşmasını bekleyin. 10 dakika sonra, plaka almak ve her kuyuya önceden ısıtılmış organoid tam medya bir mililitre ekleyin. Organoid kültürler genellikle kültür yoğunluğu ve çoğalması bağlı olarak yedi ila 10 gün içinde geçit edilir.Gerekirse, büyüme faktörü tükenmesi ve buharlaşma telafi etmek için her beş günde bir önceden ısıtılmış organoid tam medya 200 mikrolitre ile kültürleri kontör. Organoidlerden tek hücreleri izole ettikten sonra, insan organoid tam medya bir mililitre tek hücreleri resuspend. Ardından, hücrenin canlılığını kaydettiğinden emin olmak için hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın.Bir mililitre süspansiyonmevcut hücre ve canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın. Sonra 400.000 hücreye eşdeğer hacmi çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. 7.2 mililitre kadar hacmi getirmek için bu tüp organoid tam medya ekleyin.Terapötik testler için, 800 mikrolitre BME'yi 7,2 mililitre organoid komple media ile karıştırarak hücreleri kaplamaya hazırlayın. Karışımı buzda tutulan bir rezervuara aktarın ve 12 kanallı pipet kullanarak bu karışımın 20 mikrolitresini 384 kuyulu bir plakanın her kuyusu içine koyun ve bu da kuyu başına yaklaşık 1.000 hücrenin kaplanmasıyla sonuçlanır. Daha sonra bir salıncak kovasında bir dakika boyunca 100 kez g'de plakayı aşağı çevirin ve plakayı 37 santigrat derecede bir doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.24 saat sonra, organoidlerin varlığını kontrol etmek için brightfield mikroskobu kullanın. Bu çalışmada, hasta kaynaklı PDAC organoid izole edilmiş, genişletilmiş ve karakterizedir. PDAC organoidlerin izole edilmesiile ilgili zorlukları göstermek için, küçük bir hiposellüler tümör örneğinden hasta kaynaklı organoid kültürü oluşturulur.Organoidlerin iki hafta içinde daha da büyümesine izin verilir ve daha sağlam bir kültür oluşturmak için protokole göre geçiş yapılır. Kurulan ve hızlı büyüyen temsilcisi PDAC organoid tek hücreler daha sonra farmakotipleme protokolünün sonucunu göstermek için hazırlanır. 1,000 canlı hücre her kuyuda kaplanır ve sitotoksik kemoterapötik ajanlar dosed önce 24 saatlik bir süre içinde kurtarmak için izin verilir.9.0 doz töz, düşük doz100 pikomolar ile başlayan ve iki mikromolar yüksek doz ile biten triplicate yapılır. Beş günlük bir tedaviden sonra, araçla tedavi edilen kuyular ve her kemoterapötik ajanın yüksek dozu ile temsili fotoğraflar çekilir. Fotoğrafları çektikten hemen sonra, hücre canlılığı Parlak hücre canlılığı reaktifi kullanılarak değerlendirilir ve grafik yazılımı kullanılarak çizilir.Hasta kaynaklı organoidler heterojen morfolojilere sahip olabilir. Bu nedenle, her kültür için enzimatik ayrışmaları optimize etmek önemlidir. Hasta kaynaklı modellerin downstream analizi genellikle DNA ve RNA yeni nesil sıralama içerir.Mümkünse, primer doku örneklerini kullanarak modellerin moleküler özelliklerini doğrulayın. Bireyselleştirilmiş organoid kültürler pankreas kanseri hastaları için kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için olasılık açın. Fenol-kloroform ve kemoterapötik ajanlar gibi tehlikeli kimyasalların uygun PPE ve güvenlik ekipmanları ile ele alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Karşılaştırmalı Ilaç değerlendirmesi için ev sahipleri olarak zebrafish larvaları kullanarak pankreas kanserinin hasta türevi heterojen xenograft modeli

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Murine Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Ultrason Eşliğinde Ortotopik İmplantasyonu

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Pankreatik adenokarsinomun tümör mikroçevresini araştırmak için proksimal sıvıların izolasyonu

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Santral Sinir Sistemi Metastazının Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Kurulması ve Kullanılması

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Kemosensitivite Testi için Pankreas Kanserinden Zebra Balığı Hasta Kaynaklı Ksenogreftlerin Kurulması

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...