Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

ويشكر المؤلفان صوفي باترير وماريان باريسي لمشاركتهما بروتوكول التدفق الخلوي الأصلي ، و Promega و Qiagen لتوفير الإمدادات والكاشفات. وقد حظي هذا العمل بدعم من الهيئة الكندية لأعاده الإنتاج والمعهد الR.S. للبحوث الصحية (MOP-130364) إلى المركز الكوري لبحوث الصحة.

وقد وافق مجلس المراجعة المؤسسية في مكغيل علي هذه الدراسة البحثية. وقدم جميع المرضي موافقه خطيه للمشاركة في الدراسة والحصول علي منتجات FFPE من الحمل (POCs) استردادها من أقسام الامراض المختلفة.
ملاحظه: في حين ان هناك العديد من الطرق لتحديد النظام الجيني واللوني بواسطة قي...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM هي حالات الحمل البشري غير الطبيعية مع المسببات غير المتجانسة ولها أنواع مختلفه من الانسجه والأنماط الجينية ، مما يجعل تصنيفها الدقيق والتشخيص الصعب. وغالبا ما ثبت ان التقييم المورفولوجية غير دقيق وغير موثوق به من تلقاء نفسه لتصنيف HM في اليه تبادل أليات و PHM وتمييزها عن الإجهاض غير المول?...

والخلد الورم (HM) هو الحمل البشري غير طبيعيه تتميز النمو الجنيني غير طبيعي ، فرط انتشار تروفوبلاست ، وانحطاط هيدروبيك من الزغب المشيميه (CV). تاريخيا ، كانت HM تنقسم إلى نوعين ، كامله HM (اليه تبادل أليات) وجزئيه HM (PHM) استنادا فقط علي التقييم المورفولوجية1. ومع ذلك ، فقد تبين ان التقييم المورفولوجية وحده لا يكفي لتصنيف HM في النوعين الفرعيين (اليه تبادل أليات و phm) وتمييزها عن الإجهاض غير المولي2،3،4.
لان اليه تبادل أليات و PHM لها ميول مختلفه إلى الأورام الخبيثة ، ولذلك فمن المهم ان تحدد بدقه نوع النمط الجيني من HM لتوفير المتابعة المناسبة والاداره للمرضي. ونتيجة لذلك ، تم في العقود الماضية وضع وتطوير عده منهجيات لغرض تحديد مساهمه الوالدين في الانسجه المولية والتوصل إلى تصنيف صحيح لصاحبه الجلالة. وتشمل هذه تحليل النمط الحقيقي ، وتعدد الكروموسومات النطاقات ، البشرية مستضد الكريات البيضاء (هلا) الكتابة المصلية ، وتقييد طول الجزء المتعدد الاشكال ، وعدد متغير من تكرار ترادفي ، التنميط الجيني الميكروي ، والتدفق الخلوي ، و p57 KIP2 مناعي. وقد سمح هذا التقسيم الدقيق لمفاهيم HM استنادا إلى مساهمه الوالدين في الجينوم الخاصة بهم ، علي النحو التالي: اليه تبادل البيانات ، والتي هي أحاديه اللون andropermic أو مضاعف التشتت اندروجيني ، و phm ، والتي هي triploid ، التشتت في 99 ٪ و أحاديه الميكروفون في 1 ٪ من الحالات5،6،7،8. وعلاوة علي ذلك ، هناك نوع آخر من النمط الجيني من HM التي ظهرت في العقدين الماضيين ، وهو ثنائي اللون ثنائيه اللون. وهذه الاخيره متكررة في معظمها وقد تؤثر علي فرد واحد من افراد الاسره (الحالات البسيطة) أو علي ما لا يقل عن فردين من الاسره (الحالات العائلية). هذه الشامات مضاعف ثنائي الطور غالبا ما تسببها طفرات متنحي في NLRP7 أو KHDC3L في المرضي9,10,11,12. Diploid ثنائي الطور HM في المرضي الذين يعانون من طفرات متنحي في NLRP7 يمكن تشخيصها بأنها اليه تبادل أليات أو phm عن طريق التحليل المورفولوجية وهذا يبدو ان تترافق مع شده الطفرات في المرضي13,14. بالاضافه إلى تصنيف HM وفقا لأنماطها الجينية ، سمح إدخال واستخدام العديد من أساليب التنميط الجيني بالتمييز بين مختلف الكيانات المولية من الإجهاض غير المولي ، مثل التصاميم ثنائيه اللون أخرى أنواع التصاميم5,15. هذه المفاهيم قد يكون لها بعض الانتشار تروفوبلاست والشكل الخسيس الشاذة التي تحاكي ، إلى حد ما ، بعض الميزات المورفولوجية من HM.
الغرض من هذه المادة هو توفير بروتوكولات مفصله لتعدد النماذج الجينية وتدفق الخلوية من formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه (FFPE) ، وتحليلات شامله لنتائج هذه الأساليب وتكاملها مع أساليب أخرى التشخيص الصحيح والقاطع للانسجه المولية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

الخلد hydatidiform (HM) هو الحمل البشري غير طبيعيه تتميز الانتشار المفرط تروفوبلاستيك والتنمية الجنينية غير طبيعيه. هناك نوعان من HM استنادا إلى التقييم المورفولوجية المجهرية ، كامله HM (اليه تبادل أليات) وجزئيه HM (PHM). ويمكن تقسيمها بشكل أكبر علي أساس مساهمه الوالدين في الجينوم المولي. هذا التوصيف لل HM ، من خلال تحليلات المورفولوجية والنمط الجيني ، هو أمر حاسم لأداره المرضي والفهم الأساسي لهذه الامراض المثيرة للاهتمام. ومن الموثق جيدا ان التحليل المورفولوجية لصاحبه الجلالة يخضع لتقلبات واسعه بين المراقبين وليس كافيا من تلقاء نفسه لتصنيفها بدقه في اليه تبادل أليات و PHM وتمييزها عن الإجهاض المائي غير المولي. يتم اجراء تحليل التنميط الجيني في الغالب علي الحمض النووي والانسجه من فورمالين-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من المنتجات (FFPE) من الحمل ، والتي لديها اقل من الجودة المثلي ، التالي قد يؤدي إلى استنتاجات خاطئه. في هذه المقالة ، يتم توفير بروتوكولات مفصله للتحليل الجيني متعدد الخلايا وتحليلات التدفق الخلوي للانسجه المولية FFPE ، جنبا إلى جنب مع تفسير نتائج هذه الأساليب ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والتكامل مع التقييم المورفولوجية ، p57KIP2 مناعي ، والتهجين في الموقع (FISH) للوصول إلى تشخيص صحيح وقوي. وفي هذا الصدد ، يتقاسم المؤلفون الأساليب والدروس المستفادة في السنوات العشر الماضية من تحليل ما يقرب من 400 منتجا من الحمل.

تعقيد الانسجه المولية وحقيقة انها قد يكون لها مختلف الأنماط الجينية يتطلب تحليلا صارما واستخدام عده طرق مثل التقييم المورفولوجية ، p57 مناعي ، التنميط الجيني الميكروي ، والتدفق الخلوي ، والأسماك. علي سبيل المثال ، تمت أحاله مريض واحد (1790) مع اثنين phm التي تم العثور عليها لت...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

الشامات الوراثية هي حالات الحمل البشري غير الطبيعية مع المسببات غير المتجانسة التي يمكن تصنيفها وفقا لخصائصها المورفولوجية ومساهمه الوالدين في الجينوم المولي. وفي هذا الصدد ، توصف بالتفصيل البروتوكولات المتعلقة بالتنميط الجيني للحمض النووي المتعدد الميكروي وتدفق الخلايا الخلوية من فورمالين-الانسجه المولية الثابتة من البارافين ، إلى جانب تفسير النتائج وتكاملها.

التحليل الخلوي للحمض النووي الثنائي الميكروي والتدفق المضخم للخلايا من Formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه المولية

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

الميزة الأساسية لبروتوكول genotyping لدينا هو أنه يقلل من التلوث بالحمض النووي الأمومي، الذي هو التحدي الرئيسي عندما genotyping الأنسجة الولية ثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ من. تدفق cytometry هو طريقة سريعة وغير مكلفة التي تسهل إلى حد كبير تشخيص الشامات hydatidiform. لكل formalin ثابت البارافين جزءا لا يتجزأ، أو FFPE، المنتج من الحمل، وإعداد أربعة ميكرون سميكة الهماتوسلين واليوسين وصمة عار القسم كما هو مفصل في هذا الفيديو للتقييم المورفولوجية عن طريق المجهر.ضع كتل FFPE على الجليد لمدة 15 دقيقة لتسهيل عملية القطاعات. ضبط microtome لقطع المقاطع التي هي أربعة ميكرون سميكة للتقييم المورفولوجي المجهري. وضع كتلة الباردة في microtome وقطع قسم واحد من كل كتلة لH & E تلطيخ.باستخدام ملقط، نقل كل قسم إلى حمام الماء 45 درجة مئوية. التقط القسم من حمام الماء مع شريحة مشحونة بشكل إيجابي سبق تسميتها برقم تعريف العينة باستخدام قلم رصاص. ضع الشرائح التي تحتوي على المقاطع في فرن عند درجة حرارة 65 درجة مئوية للسماح للأبواب بالتمسك بالشرائح.تبقى الشرائح في الفرن لمدة 25 دقيقة. تنفيذ تلطيخ H & E عن طريق غمر الشرائح في الجرار تلطيخ المناسبة للفترة الزمنية الصحيحة كما جدولة في بروتوكول النص. قم بتركيب الأجزاء ذات الميكرنات الأربعة للتحليل المورفولوجي مع وسيط التركيب.وتغطي مع زلات الغطاء الزجاجي. باستخدام الشرائح H & E والمجهر الخفيف، حدد كتلة FFPE التي لديها أكبر كمية من الزغب chorionic. وإذا كان ذلك ممكنا، كتلة التي لديها الزغب المشيمي منفصلة عن وليس تختلط مع أنسجة الأم.ضبط microtome لقطع المقاطع التي هي 10 ميكرون سميكة لاستخراج الحمض النووي. قطع 10 إلى 30 أقسام، اعتمادا على كمية من الزغب chorionic في الكتلة. بعد التقاط المقاطع مع الشرائح كما كان من قبل، ضع الشرائح التي تحتوي على أقسام في فرن في 65 درجة مئوية للسماح المقاطع إلى الالتزام الشرائح.تبقى الشرائح في الفرن لمدة 20 دقيقة. تنفيذ تلطيخ H & E عن طريق غمر الشرائح في الجرار تلطيخ المناسبة للفترة الزمنية الصحيحة كما جدولة في بروتوكول النص. اترك الشرائح تحت غطاء الدخان لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات حتى تتبدد روائح الزيلين السامة.باستخدام ملقط، المسيل للدموع قطعة صغيرة من الورق من مسح الورق مبللة. تحت مجهر ستيريو خفيف، استخدم ملقط وقطع صغيرة من مناديل الورق المبللة بالماء لتكشط جميع أنسجة الأمومة غير المرغوب فيها من بقع H&E 10 ميكرون سميكة. مفتاح هذه الخطوة هو الصبر، وخاصة بالنسبة للكم الكتل الصعبة.من المهم أيضا أن يكون شخص آخر نلقي نظرة لضمان عدم وجود أنسجة الأمومة غاب. الآن، المسيل للدموع قطعة جديدة من الورق من مناديل الورق مبللة واستخدامها لجمع الزغب chorionic. ضع قطع مناديل الورق مع الزغب الترمي المرفقة في أنبوب 1.5 مل المسمى.تقليل كمية من مناديل الورق المستخدمة في هذه الخطوة كما أن الكثير قد تسد العمود استخراج الحمض النووي وبالتالي تقليل الكمية النهائية من الحمض النووي التي تم جمعها. اتبع بروتوكول استخراج الحمض النووي من عدة FFPE لإجراء استخراج الحمض النووي. باستخدام مطياف المختبر، تحميل 1 ميكرولتر من الحمض النووي وقياس الامتصاص في 216 نانومتر من أجل القياس الكمي.تحميل 1 ميكرولتر من الحمض النووي على جل agarose 2٪ وتشغيل جل الكهرباء في الجهد من 80 إلى 100 فولت للتقييم النوعي. استناداً إلى نتائج تقييم الحمض النووي، اختر حجم الحمض النووي لاستخدامها في التضخيم تكرار PCR قصير الترادف متعدد. تهدف إلى استخدام الحد الأدنى من 1000 نانوغرام من الحمض النووي.انتقل إلى تضخيم PCR، والكهرباء الشعرية، وتحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. لاختيار كتلة FFPE المثالي، استخدم شرائح H & E على مجهر خفيف لتحديد كتلة FFPE التي لديها حوالي 50 إلى 70٪ من أنسجة تتألف من الزغب المشيمي. بالنسبة للكميات التي لا تحتوي على الكمية المثالية من الزغب المشيمي ، قم بإثراء الزغب المشيمي أثناء تنفيذ القسم.للقيام بذلك، تحديد أي جانب من أقسام قطع الطازجة يحتوي على أكثر من الزغب chorionic وفقا لH & E الشريحة المقابلة. ثم، استخدم شفرة لقطع النصف الآخر الذي يحتاج إلى التخلص منه من أجل إثراء الزغب المشيمي. لأداء قسم من كتلة أفضل FFPE ممكن، وقطع أربعة أقسام التي هي 50 ميكرون سميكة باستخدام microtome.في حالة عدم توفر كتلة FFPE مثالية ، تهدف إلى الحفاظ على نسبة الزغب المشيمي إلى أنسجة الأم مع ذلك. على سبيل المثال، إذا كانت 30٪ فقط من الكتلة تتكون من الزغب المشيمي، في حين أن البقية لديها أنسجة الأمومة، ثم إزالة ما لا يقل عن نصف القسم الذي يحتوي على أنسجة الأمهات، واستخدام المزيد من المقاطع للتعويض. ضع الأقسام في أنابيب 15 مل المسمى.من أجل إزالة الاحتياف وإعادة الإماهة، اعمل في غطاء أبخرة لإضافة كل كاشف وانتظر الفترة الزمنية المناسبة كما تم جدولته في بروتوكول النص. ثم، إزالة الكاشف عن طريق شفط فراغ مع ماصة باستور. المقبل، إضافة أربع درجات مئوية حل سيترات لأنابيب 15 مل.بعد وضع في حمام الماء 80 درجة مئوية لمدة ساعتين، والسماح للمحلول تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. إزالة حل سيترات عن طريق شفط الفراغ. إضافة ستة ملليلتر من 1x PBS، دوامة، وانتظر من دقيقة إلى دقيقتين للسماح للأنسجة لتسوية إلى أسفل.إذا لزم الأمر، الطرد المركزي العينات في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. إزالة 1X PBS عن طريق شفط فراغ. الآن إضافة مل واحد من محلول البيبسين المُحمّى مسبقاً، ثم ضعه في حمام جاف 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.دوامة كل 10 دقائق. إعداد مادة اليوديد الريبوينوتشيم A حل في آخر 10 دقائق من هذا الحضانة. إضافة آخر ستة مل من 1X PBS، دوامة، وانتظر من دقيقة إلى دقيقتين للسماح للأنسجة لتسوية إلى أسفل.مرة أخرى ، وإزالة 1X PBS عن طريق شفط الفراغ. إضافة 550 ميكرولترات من مادة يوديد الريبوينوتشيم A، ووضع العينات في حمام جاف 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدام ملقط لوضع خمسة سم في خمسة سم قطعة من 48 ميكرون شبكة الترشيح في الجزء العلوي من أنابيب البوليسترين أسفل جولة للاستخدام مع تدفق cytometer.تصفية الحل عن طريق الأنابيب السائل من خلال شبكة وإلى أنبوب. العينات جاهزة الآن ليتم تشغيلها على مقياس التدفق. الاحتفاظ بها ملفوفة في احباط حتى أنها على استعداد ليتم تشغيلها.وأخيراً، قم بإجراء تحليل تدفق الثغرات والبيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. القمر الصناعي المجهري genotyping من الخلد هيداتيفورم جزئي، جنبا إلى جنب مع الحمض النووي للمريض وشريكها، ويكشف أن الخلد المريض هو غير صحيح ثلاثي. أول علامة 1 يظهر اثنين من القمم في نتاج الحمل.نشأت الذروة الأولى من الأم، لأن الأم وحدها لديها ذروة بهذا الحجم. بعد نفس المنطق، تأتي الذروة الثانية من الأب لأنه يشترك في نفس الغيل. لاحظ كيف أن الذروة الثانية هي أعلى بكثير من الأولى، مشيرا إلى أن هناك على الارجح جرعتين من الأليل الأب نفسه في تلك الذروة.تلوث الأمهات هو الحد الأدنى جدا في هذا المنتج من الحمل لأنه يعرض ذروة صغيرة جدا في موقف من الأليل الأم الثانية. تُظهر العلامة الثانية ثلاث قمم في ناتج الحمل. اثنين من هذه القمم تنبع من الأب، وواحدة من الأم.العلامتان الثالثة والرابعة متشابهتان مع العلامة الأولى، وتظهران أيضاً آليلين قادمين من الأب، وواحدة من الأم. منذ جميع علامات الأربعة تظهر باستمرار ثلاثة أليل، اثنان من أصل الأب وواحد من الأم، يمكن للمرء أن يستنتج أن هذا المنتج من الحمل هو غير صادق ثلاثي ويؤكد تشخيص الخلد الجزئي. لتفسير نتائج الـ genotyping، من المهم أن تكون على دراية بمستوى التلوث بناءً على الملاحظات التي تم أخذها أثناء خطوات التنظيف.وبالنسبة لبعض الحالات، لا يمكننا التوصل إلى استنتاج باتباع هاتين الطريقتين. في مثل هذه الحالات، نستخدم أساليب أخرى مثل FISH، للكشف عن الأنماط الجينية الحقيقية. وقد سمح استخدام السواتل الصغرى الجينية بالتشخيص الدقيق للضاوي ومهد الطريق لفهم أفضل للنمط الجيني المرتبط بالملامح المختلفة للشامات الهيداتية.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

تقييم التلوث الحمض النووي في عينات الحمض النووي الريبي استناداً إلى ريبوسومال الحمض النووي

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

عالية الدقة ذوبان ير ل تكمل مستقبلات 1 طول تعدد الأشكال التنميط الجيني: أداة مبتكرة لمرض الزهايمر الجينات تقييم القابلية

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

تسلسل ميكرورنا أثر رجعي: الحمض النووي التكميلية المكتبة إعداد بروتوكول باستخدام عينات الفورمالين--الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الحمض النووي الريبي

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

الجينات المرشح الاختبار في الدراسات الفوجية السريرية مع التنميط متعدد والطيف الكتلي

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

قياس BK-polyomavirus غير الترميز السيطرة المنطقة مدفوعة النشاط النسخي عن طريق قياس التدفق

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...