Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Forfatterne takker Sophie patrier og Marianne parésy for at dele den oprindelige flow flowcytometri-protokol og promega og qiagen for forsyninger og reagenser. Dette arbejde blev støttet af Réseau Québécois en reproduktion og det canadiske Institut for sundhedsforskning (MOP-130364) til R.S.

Denne undersøgelse blev godkendt af McGill institutions revisions bestyrelse. Alle patienter gav skriftligt samtykke til at deltage i undersøgelsen og til at have deres FFPE produkter af undfangelse (POCs) hentet fra forskellige patologiske afdelinger.
Bemærk: Selv om der findes flere metoder til genotypebestemmelse og Ploidi bestemmelsen af flowcytometri, beskriver protokollerne her en analysemetode, der anvender én platform til hver.
1. genotype...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM er unormale humane graviditeter med heterogene ætiologier og har forskellige histologiske og genotypiske typer, hvilket gør deres nøjagtige klassificering og diagnose udfordrende. Histopatologiske morfologiske vurderinger blev ofte påvist unøjagtige og er derfor upålidelige i sig selv til at klassificere HM i CHM og PHM og skelne dem fra ikke-molære aborter. Derfor kræver en nøjagtig diagnose af HM brug af andre metoder såsom multiplex-DNA-genotypebestemmelse, Ploidi-analyse ved flow cytometri, Ploidi-analys...

En hydatidiform mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet karakteriseret ved unormal fosterudvikling, hyperproliferation af trophoblast, og hydropic degeneration af choriongonadotropin villi (CV). Historisk, HM plejede at være opdelt i to typer, komplet HM (CHM) og delvis HM (PHM) baseret kun på morfologiske evaluering1. Det har imidlertid vist sig, at morfologisk evaluering alene ikke er tilstrækkelig til at klassificere HM i de to undertyper (chm og PHM) og skelne dem fra ikke-molære aborter2,3,4.
Da CHM og PHM har forskellige tilbøjeligheder til maligniteter, er det derfor vigtigt præcist at bestemme den genotypiske type HM for at give patienterne passende opfølgning og ledelse. Derfor er der i de seneste årtier blevet udviklet og udviklet flere metoder med henblik på at identificere forældrenes bidrag til molarvæv og opnå en korrekt klassificering af HM. Disse omfatter karyotype analyse, kromosom banding polymorfi, humant leukocytantigen (HLA) serologisk indtastning, begrænsning fragment længde polymorfi, varierende antal tandem gentagelser, microsatellite Geno Typing, flow cytometry, og P57 KIP2 immun histokemi. Dette har gjort det muligt nøjagtig underinddeling af HM forestillinger baseret på forældrenes bidrag til deres genomer, som følger: chm, som er diploide androgenetisk mono spermisk eller diploide androgen dispermic, og PHM, som er triploid, dispermic i 99% og monospermic i 1% af tilfældene5,6,7,8. Desuden er der en anden genotypisk type HM, der opstod i de sidste to årtier, som er diploide biparental. Sidstnævnte er for det meste tilbagevendende og kan påvirke et enkelt familiemedlem (simpleks tilfælde) eller mindst to familiemedlemmer (familiær tilfælde). Disse diploide biforældres modermærker er for det meste forårsaget af recessive mutationer i NLRP7 eller KHDC3L hos patienterne9,10,11,12. Diploid biparental HM hos patienter med recessive mutationer i NLRP7 kan diagnosticeres som chm eller PHM ved morfologisk analyse, og dette synes at være forbundet med sværhedsgraden af mutationer i patienterne13,14. Ud over klassificeringen af HM i henhold til deres genotyper tillod indførelsen og brugen af flere genotypebestemmelse at skelne mellem de forskellige molære enheder fra ikke-molære aborter, såsom aneuploide diploide biforældres forestillinger og andre typer af forestillinger5,15. Sådanne forestillinger kan have nogle trofoblast spredning og unormal villøs morfologi, der efterligner, til en vis grad, nogle morfologiske træk af HM.
Formålet med denne artikel er at tilvejebringe detaljerede protokoller for multiplex genotypebestemmelse og flowcytometri af formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE) væv, og omfattende analyser af resultaterne af disse metoder og deres integration med andre metoder til korrekt og endegyldig diagnose af molære væv.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

Hydatidiform mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet karakteriseret ved overdreven trofoblastiske proliferation og unormal fosterudvikling. Der er to typer af HM baseret på mikroskopisk morfologisk evaluering, komplet HM (CHM) og partiel HM (PHM). Disse kan opdeles yderligere på grundlag af forældrenes bidrag til molære genomer. En sådan karakterisering af HM, af morfologi og genotype analyser, er afgørende for patienthåndtering og for den grundlæggende forståelse af denne spændende patologi. Det er veldokumenteret, at morfologisk analyse af HM er underlagt bred interobserver variabilitet og er ikke tilstrækkelig i sig selv til præcist at klassificere HM i CHM og PHM og skelne dem fra hydropic ikke-molære aborter. Genotyping analyse udføres for det meste på DNA og væv fra formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) produkter af undfangelse, som har mindre end optimal kvalitet og kan derfor føre til forkerte konklusioner. I denne artikel gives der detaljerede protokoller for multiplex-genotypebestemmelse og flowcytometri-analyser af FFPE molarvæv sammen med fortolkningen af resultaterne af disse metoder, deres fejlfinding og integrationen med den morfologiske evaluering , P57KIP2 Immunhistokemi og fluorescens in situ-hybridisering (fisk) for at nå frem til en korrekt og robust diagnose. Her, forfatterne deler de metoder og erfaringer i de seneste 10 år fra analysen af ca. 400 produkter af undfangelse.

Kompleksiteten af molære væv og det faktum, at de kan have forskellige genotyper nødvendiggør streng analyse og anvendelse af flere metoder såsom morfologiske evaluering, P57 immunhistochemistry, microsatellite genotypebestemmelse, flow cytometri, og fisk. For eksempel, en patient (1790) blev henvist med to PHM, der blev fundet at være triploide ved mikroarray analyse af POCs kun. Patienten blev derfor diagnosticeret med recidiverende PHM. Microsatellite genotype bestemmelse af hend...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiform modermærker er unormale humane graviditeter med heterogene ætiologier, der kan klassificeres efter deres morfologiske egenskaber og forældrenes bidrag til molære genomer. Her beskrives protokoller for multiplex-DNA-genotypebestemmelse og flowcytometri af formalin-fast paraffin-indlejret molarvæv i detaljer sammen med resultaterne ' tolkning og integration.

Mikrosatellitdna-genotypebestemmelse og flow cytometri-Ploidy analyser af formalin-fast paraffin-indlejret Hydatidiform Molarvæv

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Den primære fordel ved vores genotypebestemmelsesprotokol er, at den minimerer forurening med moder-DNA, hvilket er den største udfordring, når viotypebestemmelse formalin-faste, paraffin-indlejrede kindtandvæv. Flow cytometri er en hurtig og billig metode, der i høj grad letter diagnosticering af hydatidiform modermærker. For hver formalin-fast paraffin-indlejret, eller FFPE, produkt af undfangelsen, forberede en fire-mikron tyk hæmatoxylin og eosin plet sektion som beskrevet i denne video til morfologisk evaluering ved mikroskopi.Placer FFPE blokke på is i 15 minutter for at lette nittet. Juster mikrotomen for at skære sektioner, der er fire mikroner tykke til mikroskopisk morfologisk vurdering. Placer den kolde blok i mikrotomen og skær en sektion fra hver blok for H & E farvning.Brug snaft, overføre hver sektion til en 45 grader Celsius vandbad. Saml afsnittet op fra vandbadet med et positivt ladet dias, der tidligere var mærket med prøveidentifikationsnummeret med en blyant. Placer de dias, der indeholder sektionerne, i en ovn ved 65 grader Celsius for at gøre det muligt for sektionerne at holde sig til objektglassene.Hold objektglassene i ovnen i 25 minutter. Udfør H&E-farvning ved at nedsænke diasene i de relevante farvningsglas i den korrekte tidsperiode, som er tabuleret i tekstprotokollen. Monter de fire mikron sektioner til morfologisk analyse med montering medium.Og dække med glas dække glider. Ved hjælp af H & E dias og et lys mikroskop, skal du vælge FFPE blok, der har den største mængde af chorionic villi. Og hvis det er muligt, den blok, der har chorionic villi adskilt fra og ikke blandet med moderlige væv.Juster mikrotomen for at skære sektioner, der er 10 mikron tykke til DNA-ekstraktion. Skær 10 til 30 sektioner, afhængigt af mængden af chorionic villi i blokken. Når du har samlet sektionerne op med dias som før, skal du placere de dias, der indeholder sektionerne, i en ovn ved 65 grader Celsius for at gøre det muligt for sektionerne at holde sig til objektglassene.Hold objektglassene i ovnen i 20 minutter. Udfør H&E-farvning ved at nedsænke diasene i de relevante farvningsglas i den korrekte tidsperiode, som er tabuleret i tekstprotokollen. Lad objektglassene være under røghætten i mindst tre timer, for at de giftige xylenlugt kan spredes.Brug af en vis, rive et lille stykke papir ud af en fugtet papir tørre. Under et let stereomikroskop skal du bruge de sådanne hvin og små stykker vandfugtede papirservietter til at skrabe alle uønskede maternel væv af H&E-pletter 10 mikrotykke sektioner. Nøglen til dette skridt er tålmodighed, især for udfordrende blokke.Det er også vigtigt at have en anden tage et kig for at sikre, at ingen modervæv er savnet. Nu rive et nyt stykke papir ud af fugtet papir klude og bruge det til at indsamle chorionic villi. Læg papirservietterne med deres påsatte chorionic villi i et mærket 1,5 ml rør.Minimer mængden af papirservietter, der anvendes i dette trin, da for meget kan tilstoppe DNA-ekstraktionssøjlen og dermed reducere den endelige mængde indsamlet DNA. Følg DNA-ekstraktionsprotokollen fra et FFPE-kit for at udføre DNA-ekstraktion. Ved hjælp af et laboratoriespektrofotometer indlæses 1 mikroliter DNA og måles absorbans ved 216 nm til kvantificering.Belastning 1 mikroliter AF DNA på en 2% agarose gel og køre gel elektroforese ved en spænding på 80 til 100 volt for kvalitativ evaluering. Baseret på DNA evalueringsresultater, vælge mængden af DNA, der skal anvendes i multiplex korte tandem gentageLSE PCR forstærkning. Målet er at bruge mindst 1000 nanogram DNA.Fortsæt til PCR-forstærkning, kapillær elektroforese og dataanalyse som beskrevet i tekstprotokollen. For at vælge den ideelle FFPE blok, skal du bruge H & E dias på et lys mikroskop for at vælge en FFPE blok, der har omkring 50 til 70% af sit væv består af chorionic villi. For blokke, der ikke har den ideelle mængde chorionic villi, berige for chorionic villi som sektion udføres.For at gøre dette, identificere, hvilken side af frisk-cut sektioner indeholder mere chorionic villi i henhold til dens tilsvarende H & E dias. Brug derefter en klinge til at afskære den anden halvdel, der skal kasseres for at berige for chorionic villi. For at udføre skæring af den bedst mulige FFPE blok, skære fire sektioner, der er 50 mikron tyk ved hjælp af en microtome.I tilfælde af, at en ideel FFPE blok ikke er tilgængelig, tilstræbe at opretholde forholdet mellem chorionic villi til maternel væv alligevel. For eksempel, hvis kun 30% af blokken består af chorionic villi, mens resten har modervæv, derefter fjerne mindst halvdelen af den sektion, der indeholder moderens væv, og bruge flere sektioner til at kompensere. Sektionerne anbringes i 15 ml rør.Til deparaffinisering og rehydrering skal du arbejde i en røghætte for at tilføje hvert reagens og vente den relevante tidsperiode som tabuleret i tekstprotokollen. Derefter fjernes reagenset ved vakuumsugning med en Pasteur pipette. Dernæst tilsættes fire grader Celsius citrat opløsning til 15 ml rør.Efter placering i en 80 grader Celsius vandbad i to timer, lad opløsningen køle ned til stuetemperatur. Fjern citratopløsningen ved vakuumsugning. Tilføj seks milliliter 1x PBS, vortex, og vent et til to minutter for at tillade væv til at bosætte sig til bunden.Hvis det er nødvendigt, centrifuge prøverne ved 1000 RPM i 30 sekunder. Fjern 1X PBS ved vakuumsugning. Nu tilsættes en ml forvarmet pepsin opløsning og sted i en 37 grader Celsius tørt bad i 30 minutter.Vortex hvert 10. Forbered propidium iodid ribonuclease En opløsning i de sidste 10 minutter af denne inkubation. Tilføj yderligere seks ml 1x PBS, vortex, og vent et til to minutter for at tillade væv til at bosætte sig til bunden.Igen skal du fjerne 1x PBS ved vakuumsugning. Der tilsættes 550 mikroliter af propidiumidodid ribonuclease En opløsning, og prøverne i et 37 grader Celsius tørt bad i 30 minutter. Brug antængeglas til at placere et stykke 48 cm 48 mikronfiltreringsnet på fem cm i den øverste del af polystyrenrundebundsrør til brug sammen med flowcytometeret.Opløsningen filtreres ved at pipete væsken gennem masken og ind i røret. Prøverne er nu klar til at blive kørt på flow cytometer. Hold dem pakket ind i folie, indtil de er klar til at blive kørt.Endelig udføre flow cytometri og dataanalyse som beskrevet i tekstprotokollen. Microsatellit genotyping af en delvis hydatidiform muldvarp, sammen med DNA af patienten og hendes partner, afslører, at patientens muldvarp er triploid dispermic. Den første 1. markør viser to toppe i undfangelsesproduktet.Den første top stammer fra moderen, da kun moderen har et højdepunkt af denne størrelse. Efter samme ræsonnement stammer den anden top fra faderen, da han deler den samme allel. Bemærk, hvordan den anden top er meget højere end den første, hvilket indikerer, at der sandsynligvis er to doser af samme faderlige allel i denne top.Maternel forurening er meget minimal i dette produkt af undfangelsen, fordi det viser en meget lille top på placeringen af den anden moderlig allel. Den anden markør viser tre toppe i undfangelsesproduktet. To af disse toppe stammer fra faderen, og en fra moderen.Den tredje og fjerde markører ligner den første markør, og viser også to alleler, der kommer fra faderen, og en fra moderen. Da alle fire markører konsekvent viser tre alleler, to stammer fra faderen og en fra moderen, kan man konkludere, at dette produkt af undfangelsen er triploid dispermic og bekræfter diagnosen delvis muldvarp. Til fortolkning af genotyperesultaterne er det vigtigt at være opmærksom på forureningsniveauet baseret på de noter, der blev taget under rengøringstrinnene.I nogle tilfælde kan vi ikke nå frem til en konklusion efter disse to metoder. I sådanne tilfælde bruger vi andre metoder såsom FISH, til at afdække de sande genotyper. Microsatellit genotyping har gjort det muligt for nøjagtig molar diagnose og banede vejen for bedre at forstå genotyper, der er forbundet med de forskellige funktioner i hydatidiform modermærker.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA transfektion og EMSA Analyser på frisk isoleret humant villus cytotrophoblaster

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methyl-bindende DNA capture sekventering for Patient Væv

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme Genotypebestemmelse af toksiske Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering af DNA forurening i RNA prøver baseret på ribosomale DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Højopløsnings smeltende PCR til komplementreceptor 1 Længde polymorfisme Genotyping: Et innovativt redskab til Alzheimers sygdomssensibilitetsvurdering

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation af Ploidi i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektiv mikroRNA sekventering: Supplerende DNA bibliotek forberedelse protokollen ved hjælp af Formalin-fast Paraffin-embedded RNA prøver

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidat gen test i kliniske kohorteundersøgelser med multipleksede genotypebestemmelse og massespektrometri

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Høj overførselshastighed DNA-ekstraktion og genotypebestemmelse af 3dpf zebrafisk larver af Fin klipning

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Måling af BK-Polyomavirus ikke-kodende kontrol region drevet Transkriptional aktivitet via flowcytometri

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...