Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

De auteurs bedanken Sophie Patrier en Marianne Parésy voor het delen van het originele flow cytometrie protocol, en Promega en Qiagen voor het leveren van voorraden en reagentia. Dit werk werd gesteund door de Réseau Québécois en reproductie en het Canadese Instituut voor gezondheidsonderzoek (MOP-130364) naar R.S.

Dit onderzoek werd goedgekeurd door de McGill institutioneel Review Board. Alle patiënten hebben schriftelijke toestemming gegeven om deel te nemen aan de studie en hun FFPE-producten van conceptie (Poc's) te laten ophalen uit verschillende pathologie-afdelingen.
Opmerking: Hoewel er verschillende methoden voor genotypering en ploïdie bepaling doorstroming cytometrie, de protocollen die hier worden beschreven beschrijven één methode van analyse met behulp van één platfor...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM zijn abnormale menselijke zwangerschappen met heterogene etiologieën en hebben verschillende histologische en genotypische soorten, wat hun nauwkeurige classificatie en diagnose uitdagend maakt. Histopathologische morfologische evaluatie werd vaak onnauwkeurig bevonden en is daarom onbetrouwbaar om HM in CHM en PHM te classificeren en te onderscheiden van niet-molaire miskramen. Daarom, een nauwkeurige diagnose van HM vereist het gebruik van andere methoden, zoals multiplex microsatelliet DNA genotypering, ploïdie a...

Een Mola Mole (HM) is een abnormale menselijke zwangerschap gekenmerkt door abnormale embryonale ontwikkeling, Hyper proliferatie van de trofoblast, en hydropic degeneratie van chorion Villi (CV). In het verleden werd HM gebruikt om te worden onderverdeeld in twee typen, complete HM (CHM) en gedeeltelijke HM (PHM) alleen op basis van morfologische evaluatie1. Er is echter aangetoond dat morfologische evaluatie alleen niet volstaat om HM in de twee subtypen (chm en PHM) te classificeren en ze te onderscheiden van niet-molaire miskramen2,3,4.
Omdat CHM en PHM verschillende neiging hebben tot maligniteiten, is het daarom belangrijk om het genotypische type HM nauwkeurig te bepalen om de juiste follow-up en het beheer aan de patiënten te bieden. Bijgevolg zijn in de afgelopen decennia verschillende methodologieën ontwikkeld en geëvolueerd om de ouderlijke bijdrage aan de molaire weefsels te identificeren en een correcte classificatie van HM te bereiken. Deze omvatten karyotype analyse, chromosomale banding polymorfisme, humaan leukocyten antigeen (HLA) serologische typering, restrictie fragment lengte polymorfisme, variabel aantal tandem herhalingen, microsatelliet genotypering, flow cytometrie, en p57 KIP2 immunohistochemie. Dit heeft toegestaan nauwkeurige onderverdeling van HM-concepties op basis van de ouderlijke bijdrage aan hun genomes, als volgt: CHM, die diploïde Androgenetische monospermic of diploïde Androgenetische dispermic, en PHM, die zijn triploid, dispermic in 99% en monospermic in 1% van de gevallen5,6,7,8. Bovendien, er is een ander genotypische type HM dat ontstond in de afgelopen twee decennia, dat is diploïde biparentale. Deze laatste is meestal terugkerend en kan van invloed zijn op één gezinslid (simplex gevallen) of ten minste twee familieleden (familiaire gevallen). Deze diploïde biouderlijke mollen worden voornamelijk veroorzaakt door recessieve mutaties in NLRP7 of KHDC3L bij de patiënten9,10,11,12. Diploïde biparental HM bij patiënten met recessieve mutaties in NLRP7 kan worden gediagnosticeerd als chm of PHM door morfologische analyse en dit lijkt te zijn geassocieerd met de ernst van de mutaties bij de patiënten13,14. In aanvulling op de classificatie van HM volgens hun genotypes, de invoering en het gebruik van verschillende genotypering methoden toegestaan het onderscheid van de verschillende molaire entiteiten uit niet-molaire miskramen, zoals aneuploïde diploïde biouderlijke concepties en andere vormen van concepties5,15. Dergelijke opvattingen kunnen sommige trofoblast proliferatie en abnormale villus morfologie die, tot op zekere hoogte, sommige morfologische kenmerken van HM nabootsen.
Het doel van dit artikel is om gedetailleerde protocollen te bieden voor multiplex genotypering en flow cytometrie van formalin-Fixed paraffine-ingesloten (FFPE) weefsels, en uitgebreide analyses van de resultaten van deze methoden en hun integratie met andere methoden voor juiste en afdoende diagnose van molaire weefsels.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

Hydatidiform Mole (HM) is een abnormale menselijke zwangerschap gekenmerkt door overmatige trophoblastische proliferatie en abnormale embryonale ontwikkeling. Er zijn twee soorten HM gebaseerd op microscopische morfologische evaluatie, complete HM (CHM) en gedeeltelijke HM (PHM). Deze kunnen verder worden onderverdeeld op basis van de ouderlijke bijdrage aan de molaire Genomes. Een dergelijke karakterisering van HM, door morfologie en genotype analyse, is cruciaal voor patiëntenbeheer en voor het fundamenteel begrip van deze intrigerende pathologie. Het is goed gedocumenteerd dat morfologische analyse van HM onderhevig is aan brede interobserver variabiliteit en niet voldoende is om HM nauwkeurig te classificeren in CHM en PHM en ze te onderscheiden van hydropic niet-molaire abortussen. Genotyping analyse wordt meestal uitgevoerd op DNA en weefsels van formalin-Fixed paraffine-embedded (FFPE)-producten van conceptie, die minder dan optimale kwaliteit hebben en bijgevolg tot verkeerde conclusies kunnen leiden. In dit artikel, gedetailleerde protocollen voor multiplex genotypering en flow cytometrie analyses van FFPE molaire weefsels worden verstrekt, samen met de interpretatie van de resultaten van deze methoden, hun probleemoplossing, en de integratie met de morfologische evaluatie , p57KIP2 immunohistochemie en fluorescentie in situ hybridisatie (Fish) om een correcte en robuuste diagnose te bereiken. Hier, de auteurs delen de methoden en lessen geleerd in de afgelopen 10 jaar van de analyse van ongeveer 400 producten van conceptie.

De complexiteit van molaire weefsels en het feit dat zij verschillende genotypen kunnen hebben, vereisen een strenge analyse en het gebruik van verschillende methoden, zoals morfologische evaluatie, p57 immunohistochemie, microsatelliet genoom, Flowcytometrie en vis. Bijvoorbeeld, één patiënt (1790) werd verwezen met twee PHM die bleken te zijn Triploïde door microarray analyse van de POCs alleen. De patiënt werd daarom gediagnosticeerd met terugkerende PHM. Microsatelliet genoom van...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiforme mollen zijn abnormale humane zwangerschappen met heterogene etiologieën die kunnen worden geclassificeerd op basis van hun morfologische kenmerken en de ouderlijke bijdrage aan de molaire Genomes. Hier worden protocollen van multiplex microsatelliet DNA-genotypering en Flowcytometrie van formalin-Fixed paraffine-ingesloten molaire weefsels gedetailleerd beschreven, samen met de interpretatie en integratie van resultaten.

Microsatelliet DNA genotypering en flow Cytometrie ploidy analyses van Formalin-vaste paraffine-ingesloten Hydatidiforme molaire weefsels

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Het belangrijkste voordeel van ons genotyperingprotocol is dat het besmetting met moeder-DNA minimaliseert, wat de belangrijkste uitdaging is bij het genotyperen van formeel vaste, paraffine-ingebedde molaire weefsels. Flow cytometrie is een snelle en goedkope methode die sterk vergemakkelijkt de diagnose van hydatidiform moedervlekken. Voor elke formaline-vaste paraffine-embedded, of FFPE, product van de conceptie, bereiden een vier-micron dikke hematoxylin en eosine vlek sectie zoals beschreven in deze video voor morfologische evaluatie door microscopie.Plaats de FFPE blokken op ijs gedurende 15 minuten om de sectie te vergemakkelijken. Pas de microtome aan om secties te snijden die vier micron dik zijn voor microscopische morfologische evaluatie. Plaats het koude blok in het microtome en snijd een sectie van elk blok voor H & E kleuring.Met behulp van tangen, breng elke sectie naar een 45 graden Celsius waterbad. Haal de sectie uit het waterbad met een positief geladen dia die eerder met het monsteridentificatienummer met een potlood was gelabeld. Plaats de dia's met de secties in een oven op 65 graden Celsius om de secties aan de glijbanen te kunnen houden.Houd de glijbanen 25 minuten in de oven. Voer de H&E-kleuring uit door de dia's voor de juiste periode onder te dompelen in de juiste kleurpotten, zoals in het tekstprotocol is getabuleerd. Monteer de vier-micron secties voor morfologische analyse met montagemedium.En dek af met glazen afdekbriefjes. Selecteer met behulp van de H&E-dia's en een lichtmicroscoop het FFPE-blok met de grootste hoeveelheid chorionic villi. En indien mogelijk, het blok dat chorionic villi gescheiden van en niet vermengd met moederweefsels heeft.Pas de microtome aan om secties te snijden die 10 micron dik zijn voor DNA-extractie. Snijd 10 tot 30 secties, afhankelijk van de hoeveelheid chorionic villi in het blok. Na het oppakken van de secties met dia's als voorheen, plaats de dia's met de secties in een oven op 65 graden Celsius om de secties te houden aan de dia's.Houd de glijbanen 20 minuten in de oven. Voer de H&E-kleuring uit door de dia's voor de juiste periode onder te dompelen in de juiste kleurpotten, zoals in het tekstprotocol is getabuleerd. Laat de glijbanen onder de rookkap voor een minimum van drie uur om voor de giftige xyleen geuren te verdrijven.Met behulp van tangen, scheur een klein stukje papier uit een bevochtigde papier doekje. Onder een lichte stereomicroscoop, gebruik maken van de tangen en kleine stukjes water bevochtigde papieren doekjes af te schrapen alle ongewenste moederweefsels van H & E vlekken 10-micron dikke secties. De sleutel voor deze stap is geduld, vooral voor uitdagende blokken.Het is ook belangrijk om iemand anders een kijkje te laten nemen om ervoor te zorgen dat er geen moederweefsels worden gemist. Nu, scheur een nieuw stuk papier uit de bevochtigde papieren doekjes en gebruik het om de chorionic villi te verzamelen. Doe de stukjes papierdoekjes met de bijgevoegde chorionic villi in een gelabelde buis van 1,5 ml.Minimaliseer de hoeveelheid papierdoekjes die in deze stap worden gebruikt, omdat te veel de DNA-extractiekolom kan verstoppen en daardoor de uiteindelijke hoeveelheid verzameld DNA kan verminderen. Volg het DNA-extractieprotocol van een FFPE-kit om DNA-extractie uit te voeren. Met behulp van een labspectrometer laad je 1 microliter DNA en meet je absorptie op 216 nm voor kwantificering.Laad 1 microliter DNA op een 2%agarose gel en voer gel elektroforese uit bij een spanning van 80 tot 100 volt voor kwalitatieve evaluatie. Kies op basis van de DNA-evaluatieresultaten het volume DNA dat moet worden gebruikt in de multiplex korte tandemrehalcster-versterking. Doel om minimaal 1000 nanogram DNA te gebruiken.Ga naar PCR-versterking, capillaire elektroforese en gegevensanalyse zoals beschreven in het tekstprotocol. Om het ideale FFPE-blok te kiezen, gebruikt u H&E-dia's op een lichtmicroscoop om een FFPE-blok te selecteren dat ongeveer 50 tot 70% van de weefsels heeft die bestaan uit chorionic villi. Voor blokken die niet de ideale hoeveelheid chorionic villi hebben, verrijken voor chorionic villi als de sectie wordt uitgevoerd.Om dit te doen, identificeren welke kant van de vers gesneden secties bevat meer chorionic villi volgens de bijbehorende H & E dia. Gebruik vervolgens een mes om de andere helft af te snijden die moet worden weggegooid om te verrijken voor chorionic villi. Om secties van het best mogelijke FFPE-blok uit te voeren, knipt u vier secties die 50 micron dik zijn met behulp van een microtome.In het geval dat een ideaal FFPE-blok niet beschikbaar is, moet u de verhouding van chorionic villi tot moederweefsel toch behouden. Bijvoorbeeld, als slechts 30% van het blok bestaat uit chorionic villi, terwijl de rest moederweefsels heeft, verwijder dan ten minste de helft van de sectie die de moederweefsels bevat, en gebruik meer secties om te compenseren. Plaats de secties in gelabelde buizen van 15 mL.Voor deparaffinisatie en rehydratie werkt u in een rookkap om elk reagens toe te voegen en wacht u de juiste periode zoals in het tekstprotocol is getabuleerd. Verwijder vervolgens het reagens door vacuümzuiging met een Pasteur pipet. Voeg vervolgens vier graden Celsius citraat oplossing aan de 15 mL buizen.Na het plaatsen in een 80 graden Celsius waterbad voor twee uur, laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder de citraatoplossing door vacuümzuiging. Voeg zes milliliter 1x PBS, vortex, en wacht een tot twee minuten om de weefsels te vestigen op de bodem.Indien nodig, centrifugeren de monsters op 1000 RPM gedurende 30 seconden. Verwijder de 1X PBS door vacuümzuiging. Voeg nu een mL van voorverwarmde pepsine oplossing en plaats in een 37 graden Celsius droog bad voor 30 minuten.Vortex elke 10 minuten. Bereid de propidium jodide ribonuclease Een oplossing in de laatste 10 minuten van deze incubatie. Voeg nog eens zes mL van 1x PBS, vortex, en wacht een tot twee minuten om de weefsels te vestigen op de bodem.Verwijder nogmaals de 1x PBS door vacuümzuiging. Voeg 550 microliters van de propidium jodide ribonuclease Een oplossing toe en plaats de monsters gedurende 30 minuten in een droog bad van 37 graden Celsius. Gebruik tangen om een stuk van 48 micron filtratiemessen van vijf cm bij vijf cm in het bovenste deel van polystyreen ronde bodembuizen te plaatsen voor gebruik met de stroomcytometer.Filtreer de oplossing door de vloeistof door het gaas en in de buis te vloeien. De monsters zijn nu klaar om te worden uitgevoerd op de stroom cytometer. Houd ze verpakt in folie totdat ze klaar zijn om te worden uitgevoerd.Ten slotte voert u stroomcytometrie en gegevensanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Microsatellite genotyping van een gedeeltelijke hydatidiform mole, samen met het DNA van de patiënt en haar partner, blijkt dat de moedervlek is triplid ontwrichtend. De eerste 1e marker toont twee pieken in het product van de conceptie.De eerste piek komt van de moeder, omdat alleen de moeder een piek van deze omvang heeft. Volgens dezelfde redenering, de tweede piek is afkomstig van de vader, omdat hij deelt hetzelfde allel. Merk op hoe de tweede piek is een stuk hoger dan de eerste, wat aangeeft dat er waarschijnlijk twee doses van dezelfde vaderlijke allel in die piek.Maternale besmetting is zeer minimaal in dit product van conceptie omdat het een zeer uiterst uiterst kleine piek bij de positie van het tweede moederallel toont. De tweede markering toont drie pieken in het product van de conceptie. Twee van deze pieken zijn afkomstig van de vader, en een van de moeder.De derde en vierde markers zijn vergelijkbaar met de eerste marker, en tonen ook twee allelen afkomstig van de vader, en een van de moeder. Aangezien alle vier markers consequent drie allelen vertonen, twee afkomstig van de vader en een van de moeder, kan men concluderen dat dit product van de conceptie is triploid ontwrichtend en bevestigt de diagnose van gedeeltelijke mol. Voor de interpretatie van de genotyping resultaten, is het belangrijk om bewust te zijn van het niveau van verontreiniging op basis van de notities genomen tijdens de reinigingsstappen.In sommige gevallen kunnen we naar aanleiding van deze twee methoden geen conclusie trekken. In dergelijke gevallen gebruiken we andere methoden zoals FISH, om de ware genotypen te ontdekken. Microsatelliet genotyping heeft gezorgd voor nauwkeurige molaire diagnose en de weg vrijgemaakt om de genotypen die worden geassocieerd met de verschillende kenmerken van hydatidiform mollen beter te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

-Methyl-bindende DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Hoge resolutie smeltende PCR voor Complement Receptor 1 Lengte Polymorfisme Genotypering: Een Innovatief Gereedschap voor Alzheimer&#39;s Ziekte Geneesbaarheid Beoordeling

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulatie van ploïdie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Meting van BK-polyomavirus niet-coderende controle regio gedreven transcriptionele activiteit via Flowcytometrie

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...