Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Die Autoren danken Sophie Patrier und Marianne Parésy für die gemeinsame Nutzung des ursprünglichen Flow-Zytometrie-Protokolls und Promega und Qiagen für die Bereitstellung von Vorräten und Reagenzien. Diese Arbeit wurde von der Réseau Québécois en Reproduction und dem Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) an R.S. unterstützt.

Diese Studie wurde vom McGill Institutional Review Board genehmigt. Alle Patienten gaben ihre schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an der Studie und zur Abrufung ihrer FFPE-Empfängnisprodukte (POCs) aus verschiedenen Pathologieabteilungen.
HINWEIS: Zwar gibt es mehrere Methoden zur Genotypisierung und Ploidie-Bestimmung durch Durchflusszytometrie, aber die hier bereitgestellten Protokolle beschreiben eine Analysemethode mit jeweils einer Plattform.
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	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM sind abnorme menschliche Schwangerschaften mit heterogenen Ätiologien und haben verschiedene histologische und genotypische Typen, was ihre genaue Klassifizierung und Diagnose schwierig macht. Die histopathologische morphologische Bewertung erwies sich oft als ungenau und ist daher allein unzuverlässig, um HM in CHM und PHM zu klassifizieren und von nicht-molaren Fehlgeburten zu unterscheiden. Daher erfordert eine genaue Diagnose von HM den Einsatz anderer Methoden wie Multiplex-Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung, ...

Ein hydatidiformer Maulwurf (HM) ist eine abnorme menschliche Schwangerschaft, die durch abnorme embryonale Entwicklung, Hyperproliferation des Trophoblasten und hydropische Degeneration von Chorionzotten (CV) gekennzeichnet ist. Historisch gesehen wurde HM in zwei Typen unterteilt, vollständiges HM (CHM) und partielles HM (PHM) nur auf der Grundlage der morphologischen Bewertung1. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die morphologische Bewertung allein nicht ausreicht, um HM in die beiden Subtypen (CHM und PHM) einzustufen und sie von nicht-molaren Fehlgeburten2,3,4zu unterscheiden.
Da CHM und PHM unterschiedliche Neigungen zu malignen Erkrankungen haben, ist es daher wichtig, den genotypischen Typ von HM genau zu bestimmen, um den Patienten eine angemessene Nachbeobachtung und Behandlung zu ermöglichen. Infolgedessen wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere Methoden entwickelt und entwickelt, um den elterlichen Beitrag zu den Molgeweben zu identifizieren und eine korrekte Klassifizierung von HM zu erreichen. Dazu gehören Karyotypie-Analyse, chromosomaler Banding-Polymorphismus, humanes Leukozyten-Antigen (HLA) serologische Typisierung, Restriktionsfragmentlänge Polymorphismus, variable Anzahl von Tandem-Wiederholungen, Mikrosatelliten-Genotypisierung, Durchflusszytometrie und p57 KIP2-Immunhistochemie. Dies hat eine genaue Unterteilung von HM-Konzepten auf der Grundlage des elterlichen Beitrags zu ihren Genomen ermöglicht, wie folgt: CHM, die diploid undrogenetisch monospermisch oder diploid androgenetisch dispermisch sind, und PHM, die triploid sind, dispermisch in 99% und monospermin in 1% der Fälle5,6,7,8. Darüber hinaus gibt es eine andere genotypische Art von HM, die in den letzten zwei Jahrzehnten entstanden ist, die diploid biparental ist. Letzteres ist meist wiederkehrendeund und kann ein einzelnes Familienmitglied (einfache Fälle) oder mindestens zwei Familienmitglieder (familiäre Fälle) betreffen. Diese diploiden biparentalen Maulwürfe werden meist durch rezessive Mutationen in NLRP7 oder KHDC3L bei den Patienten9,10,11,12verursacht. Diploid biparental HM bei Patienten mit rezessiven Mutationen in NLRP7 kann als CHM oder PHM durch morphologische Analyse diagnostiziert werden und dies scheint mit der Schwere der Mutationen bei den Patienten13,14verbunden zu sein. Neben der Klassifizierung von HM nach ihren Genotypen ermöglichte die Einführung und Verwendung mehrerer Genotypisierungsmethoden die Unterscheidung der verschiedenen Molentitäten von nicht-molaren Fehlgeburten, wie z. B. aneuploiden diploiden biparentalen andere Arten von Konzepten5,15. Solche Vorstellungen können einige Trophoblast-Proliferation und abnorme villous Morphologie haben, die bis zu einem gewissen Grad einige morphologische Merkmale von HM imitieren.
Der Zweck dieses Artikels besteht darin, detaillierte Protokolle für Multiplex-Genotypisierung und Durchflusszytometrie von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Geweben (FFPE) sowie umfassende Analysen der Ergebnisse dieser Methoden und deren Integration mit anderen Methoden für korrekte und schlüssige Diagnose von Molgeweben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

Hydatidiform Maulwurf (HM) ist eine abnorme menschliche Schwangerschaft, die durch übermäßige trophoblastische Proliferation und abnorme embryonale Entwicklung gekennzeichnet ist. Es gibt zwei Arten von HM, die auf mikroskopischer morphologischer Auswertung basieren, vollständiges HM (CHM) und partielles HM (PHM). Diese können auf der Grundlage des Elternbeitrags zu den Molgenomen weiter unterteilt werden. Eine solche Charakterisierung von HM durch Morphologie und Genotypanalysen ist entscheidend für das Patientenmanagement und für das grundlegende Verständnis dieser faszinierenden Pathologie. Es ist gut dokumentiert, dass die morphologische Analyse von HM einer breiten Interobserver-Variabilität unterliegt und allein nicht ausreicht, um HM genau in CHM und PHM zu klassifizieren und von hydropischen nicht-molaren Abtreibungen zu unterscheiden. Die Genotypisierungsanalyse wird hauptsächlich an DNA und Geweben aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Produkten der Empfängnis durchgeführt, die eine weniger optimale Qualität aufweisen und folglich zu falschen Schlussfolgerungen führen können. In diesem Artikel werden detaillierte Protokolle für Multiplex-Genotypisierung und Durchflusszytometrieanalysen von FFPE-Molarengeweben sowie die Interpretation der Ergebnisse dieser Methoden, deren Fehlerbehebung und Integration in die morphologische Bewertung bereitgestellt. , p57KIP2-Immunhistochemie und Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH), um eine korrekte und robuste Diagnose zu erhalten. Hier teilen die Autoren die Methoden und Lehren aus der Analyse von rund 400 Empfängnisprodukten aus den letzten 10 Jahren.

Die Komplexität von Molgeweben und die Tatsache, dass sie verschiedene Genotypen haben können, erfordern eine strenge Analyse und die Verwendung mehrerer Methoden wie morphologische Bewertung, p57-Immunhistochemie, Mikrosatellitengenotypisierung, Durchflusszytometrie und FISH. Zum Beispiel wurde ein Patient (1790) mit zwei PHM überwiesen, die nur durch Mikroarray-Analyse der POCs als triploid erwiesen wurden. Der Patient wurde daher mit wiederkehrendem PHM diagnostiziert. Die Mikrosate...

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Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Hydatidiforme Maulwürfe sind abnorme menschliche Schwangerschaften mit heterogenen Ätiologien, die nach ihren morphologischen Merkmalen und dem elterlichen Beitrag zu den Molgenomen klassifiziert werden können. Hier werden Protokolle der Multiplex-Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie von formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem Molgewebe detailliert beschrieben, zusammen mit der Interpretation und Integration der Ergebnisse.

Mikrosatelliten-DNA-Genotypisierung und Durchflusszytometrie-Ploidy-Analysen von formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Hydatidiform-Molargeweben

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

Der Hauptvorteil unseres Genotypisierungsprotokolls besteht darin, dass es die Kontamination mit mütterlicher DNA minimiert, was die größte Herausforderung bei der Genotypisierung formalinfixierter, paraffineingebetteter Molarengewebe ist. Durchflusszytometrie ist eine schnelle und kostengünstige Methode, die die Diagnose von hydatidiformen Maulwürfen erheblich erleichtert. Für jedes formal fixierte Paraffin-eingebettete oder FFPE-Produkt der Empfängnis bereiten Sie einen vier Mikrometer dicken Hämatoxylin- und Eosin-Fleckenabschnitt vor, wie in diesem Video beschrieben, um die morphologische Auswertung durch Mikroskopie durchzuführen.Stellen Sie die FFPE-Blöcke für 15 Minuten auf Eis, um den Schnitt zu erleichtern. Passen Sie das Mikrotome an Schnittabschnitte an, die für die mikroskopische morphologische Auswertung vier Mikrometer dick sind. Legen Sie den kalten Block in das Mikrotome und schneiden Sie einen Abschnitt aus jedem Block für H&E Färbung.Mit Zangen, übertragen Sie jeden Abschnitt in ein 45 Grad Celsius Wasserbad. Nehmen Sie den Abschnitt aus dem Wasserbad mit einem positiv geladenen Dia, das zuvor mit der Proben-Identifikationsnummer beschriftet war, mit einem Bleistift. Legen Sie die Dias mit den Abschnitten bei 65 Grad Celsius in einen Ofen, damit die Abschnitte an den Dias haften können.Halten Sie die Rutschen 25 Minuten im Ofen. Führen Sie die H&E-Färbung durch, indem Sie die Dias für den richtigen Zeitraum, wie im Textprotokoll aufgeführt, in die entsprechenden Färbegläser eintauchen. Montieren Sie die Vier-Mikron-Abschnitte für die morphologische Analyse mit Montagemedium.Und Abdeckung mit Glasabdeckung rutscht. Wählen Sie mit den H&E-Dias und einem Lichtmikroskop den FFPE-Block aus, der die größte Menge an Chorionzotten enthält. Und wenn möglich, der Block, der Chorionzotten hat, trennen und nicht mit mütterlichem Gewebe vermischt.Passen Sie das Mikrotome an, um Abschnitte zu schneiden, die 10 Mikrometer dick für die DNA-Extraktion sind. Schneiden Sie 10 bis 30 Abschnitte, abhängig von der Menge der Chorionzotten im Block. Nachdem Sie die Abschnitte wie zuvor mit Rutschen aufgenommen haben, legen Sie die Dias mit den Abschnitten in einem Ofen bei 65 Grad Celsius, damit die Abschnitte an den Dias haften können.Halten Sie die Dias 20 Minuten im Ofen. Führen Sie die H&E-Färbung durch, indem Sie die Dias für den richtigen Zeitraum, wie im Textprotokoll aufgeführt, in die entsprechenden Färbegläser eintauchen. Lassen Sie die Dias mindestens drei Stunden unter der Dunstabzugshaube, damit sich die giftigen Xylolgerüche auflösen.Mit Zangen ein winziges Stück Papier aus einem befeuchteten Papiertuch reißen. Verwenden Sie unter einem Licht-Stereomikroskop die Zangen und kleine Stücke von wasserbefeuchteten Papiertüchern, um alle unerwünschten mütterlichen Gewebe von H&E-Flecken 10-Mikron dicken Abschnitten abzukratzen. Der Schlüssel für diesen Schritt ist Geduld, vor allem für herausfordernde Blöcke.Es ist auch wichtig, dass jemand anderes einen Blick darauf richtet, dass kein mütterliches Gewebe verpasst wird. Nun, reißen Sie ein neues Stück Papier aus den befeuchteten Papiertüchern und verwenden Sie es, um die Chorion-Zotten zu sammeln. Legen Sie die Stücke Papiertücher mit ihren beigefügten Chorionzotten in eine beschriftete 1,5 ml Tube.Minimieren Sie die Menge an Papiertüchern, die in diesem Schritt verwendet werden, da zu viel die DNA-Extraktionsspalte verstopfen und folglich die endgültige Menge der gesammelten DNA reduzieren kann. Folgen Sie dem DNA-Extraktionsprotokoll aus einem FFPE-Kit, um die DNA-Extraktion durchzuführen. Mit Hilfe eines Laborspektrophotometers 1 Mikroliter DNA laden und die Absorption bei 216 nm zur Quantifizierung messen.1 Mikroliter DNA auf ein 2%Agarose-Gel laden und Gelelektrophorese bei einer Spannung von 80 bis 100 Volt laufen lassen, um eine qualitative Bewertung durchzuführen. Wählen Sie auf der Grundlage der DNA-Auswertungsergebnisse das VOLUMEN der DNA aus, das in der Multiplex-Kurz-Tandem-Wiederholungs-PCR-Amplifikation verwendet werden soll. Ziel ist es, mindestens 1000 Nanogramm DNA zu verwenden.Fahren Sie mit pcR-Verstärkung, Kapillarelektrophorese und Datenanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Um den idealen FFPE-Block auszuwählen, wählen Sie mit H&E-Dias auf einem Lichtmikroskop einen FFPE-Block aus, der etwa 50 bis 70 % seines Gewebes aus Chorionzotten enthält. Für Blöcke, die nicht die ideale Menge an Chorionzotten haben, bereichern Sie für Chorionzotten, wenn der Schnitt durchgeführt wird.Identifizieren Sie dazu, welche Seite der frisch geschnittenen Abschnitte mehr Chorionzotten gemäß der entsprechenden H&E-Folie enthält. Dann verwenden Sie eine Klinge, um die andere Hälfte abzuschneiden, die verworfen werden muss, um für Chorionzotten zu bereichern. Um den bestmöglichen FFPE-Block zu schneiden, schneiden Sie vier Abschnitte, die 50 Mikrometer dick sind, mit einem Mikrotom.Für den Fall, dass kein idealer FFPE-Block verfügbar ist, soll das Verhältnis von Chorionzotten zu mütterlichem Gewebe dennoch erhalten bleiben. Wenn z. B. nur 30 % des Blocks aus Chorionzotten bestehen, während der Rest mütterliche Gewebe hat, entfernen Sie mindestens die Hälfte des Abschnitts, der das mütterliche Gewebe enthält, und verwenden Sie mehr Abschnitte, um dies zu kompensieren. Platzieren Sie die Abschnitte in beschrifteten 15 ml-Rohren.Für die Deparaffinierung und Rehydratation, arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube, um jedes Reagenz hinzuzufügen und warten Sie den entsprechenden Zeitraum, wie im Textprotokoll tabellarisch aufgeführt. Entfernen Sie dann das Reagenz durch Vakuumabsaugung mit einer Pasteur-Pipette. Als nächstes fügen Sie vier Grad Celsius Citrat-Lösung zu den 15 ml-Rohren hinzu.Nachdem Sie zwei Stunden lang ein 80 Grad Celsius Wasserbad eingelassen haben, lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Entfernen Sie die Citratlösung durch Vakuumabsaugung. Fügen Sie sechs Milliliter 1x PBS, Wirbel, und warten Sie ein bis zwei Minuten, damit sich das Gewebe nach unten absetzen kann.Zentrifugieren Sie die Proben bei Bedarf 30 Sekunden lang bei 1000 U/min. Entfernen Sie die 1X PBS durch Vakuumabsaugung. Nun fügen Sie eine ml vorgewärmte Pepsin-Lösung und legen Sie in einem 37 Grad Celsius trockenen Bad für 30 Minuten.Wirbel alle 10 Minuten. Bereiten Sie die Propidiumiodidribonuklease A Lösung in den letzten 10 Minuten dieser Inkubation vor. Fügen Sie weitere sechs ml 1x PBS, Wirbel, und warten Sie ein bis zwei Minuten, damit sich das Gewebe nach unten absetzen kann.Entfernen Sie die 1x PBS wiederum durch Vakuumabsaugung. 550 Mikroliter der Propidiumiodid-Ribonuclease-A-Lösung hinzufügen und die Proben 30 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius trockenes Bad geben. Verwenden Sie Zangen, um ein fünf mal fünf cm großes Stück 48 Mikron Filtrationsgewebe im oberen Teil der Polystyrol-Rundbodenrohre für den Einsatz mit dem Durchflusszytometer zu platzieren.Filtern Sie die Lösung, indem Sie die Flüssigkeit durch das Netz in das Rohr leiten. Die Proben können nun auf dem Durchflusszytometer ausgeführt werden. Bewahren Sie sie in Folie eingewickelt auf, bis sie zum Laufen bereit sind.Führen Sie schließlich die Flusszytometrie und die Datenanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Mikrosatelliten-Genotypisierung eines partiellen hydatidiformen Maulwurfs, zusammen mit der DNA der Patientin und ihres Partners, zeigt, dass der Maulwurf des Patienten triploid dispermisch ist. Der erste 1. Marker zeigt zwei Spitzen im Produkt der Empfängnis.Der erste Gipfel stammt von der Mutter, da nur die Mutter einen Gipfel dieser Größe hat. Nach der gleichen Argumentation stammt der zweite Gipfel vom Vater, da er dasselbe Allel teilt. Beachten Sie, wie der zweite Peak viel höher als der erste ist, was darauf hindeutet, dass es wahrscheinlich zwei Dosen des gleichen väterlichen Alleels in diesem Peak gibt.Die mütterliche Kontamination ist in diesem Produkt der Empfängnis sehr gering, da sie einen sehr winzigen Spitzenwert an der Position des zweiten mütterlichen Alleels zeigt. Der zweite Marker zeigt drei Spitzen im Produkt der Empfängnis. Zwei dieser Gipfel stammen vom Vater und einer von der Mutter.Die dritte und vierte Markierung ähneln dem ersten Marker und zeigen auch zwei Allele, die vom Vater und eine von der Mutter kommen. Da alle vier Marker durchweg drei Allele aufweisen, zwei vom Vater und einer von der Mutter, kann man schlussfolgern, dass dieses Empfängnisprodukt triploid dispermisch ist und die Diagnose eines Partmolels bestätigt. Für die Interpretation der Genotypisierungsergebnisse ist es wichtig, sich des Verschmutzungsgrads bewusst zu sein, der auf den während der Reinigungsschritten gemachten Notizen basiert.In einigen Fällen sind wir nicht in der Lage, eine Schlussfolgerung nach diesen beiden Methoden zu ziehen. In solchen Fällen verwenden wir andere Methoden wie FISH, um die wahren Genotypen aufzudecken. Die Mikrosatelliten-Genotypisierung hat eine genaue Moldiagnose ermöglicht und den Weg geebnet, um die Genotypen besser zu verstehen, die mit den verschiedenen Merkmalen von hydatidiform-Molen verbunden sind.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Hochauflösende Schmelz-PCR für Komplement-Rezeptor 1 Länge Polymorphismus Genotypisierung: Ein innovatives Werkzeug für die Alzheimer-Krankheit Gen-Anfälligkeits-Assessment

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation der Diploidie in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Messung der BK-Polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...