Name: microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

המחברים מודים סופי Patrier מריאן Parésy עבור שיתוף את הפרוטוקול המקורי cy, לנסות הפרוטוקולים, פרונגה ו Qiagen לספק אספקה וריאגנטים. עבודה זו נתמכת על ידי הרבייה והמכון הקנדי לחקר בריאות (מגב-130364) לR.S.

מחקר זה אושרה על ידי הלוח סקירה מוסדית מקגיל. כל המטופלים סיפקו הסכמה בכתב להשתתף במחקר ולקבל מוצרים FFPE שלהם של תפיסה (POCs) אוחזרו ממחלקות פתולוגיה שונים.
הערה: בעוד ישנן מספר שיטות לקביעת הגנוזות ולהגדרה פלויידי על ידי הזרימה cy, הפרוטוקולים המסופקים כאן לתאר שיטה אח...

<ol>
	<li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole.">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li><li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li><li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles:+ancillary+techniques+(p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping)+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists.">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li><li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy?.">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?.</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li><li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+hydatidiform+moles:+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping.">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li><li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole.">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics &amp; Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li><li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hydatidiform+mole:+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping.">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li><li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles,+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes.">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li><li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans.">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li><li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte.">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li><li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles:+Basic+Science+and+Genetic+Counselling.">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li><li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations.">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li><li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation.">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li><li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation:+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+"partial"+or+"complete"+hydatidiform+moles.">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping.">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li><li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles:+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay.">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li></ol>

HM הם הריונות אנושיים חריגים עם חבלות הטרוגנית יש סוגים שונים היסטולוגית ו-genotypic, מה שהופך סיווג מדויק שלהם ואבחון מאתגרת. הערכה מורפולוגית היפואוולוגית הוכחה לעתים קרובות מדויק, ולכן לא אמין על עצמו לסווג HM לתוך CHM ו PHM ולהבדיל אותם מפני שאינם טוחנת הפלות. לכן, אבחנה מדויקת של HM דורש שימוש בש...

שומה מולה (HM) הוא הריון אנושי נורמלי המאופיינת התפתחות עובריים חריגים, היפרהפצה של trophoblast פיצוץ, ו הידרוpic ניוון של villi כוריוני (CV). מבחינה היסטורית, HM היה מחולק לשני סוגים, להשלים HM (CHM) חלקי HM (PHM) מבוסס רק על הערכה מורפולוגית1. עם זאת, הוכח כי הערכה מורפולוגית לבד אינה מספיקה כדי לסווג HM לתוך שני סוגי המשנה (CHM ו-phm) ולהבדיל אותם מפני הפלות לא-טוחנת2,3,4.
בגלל CHM ו PHM יש נטיות שונים כדי ממאירות, ולכן חשוב לקבוע במדויק את סוג גנוטיפ של HM כדי לספק מעקב מתאים וניהול לחולים. כתוצאה מכך, בעשורים האחרונים פותחו מספר מתודולוגיות והתפתחו לצורך זיהוי התרומה הורית לרקמות הטוחנת ולהשגת סיווג נכון של HM. אלה כוללים ניתוח קריוטיפ, פולימורפיזם פסים כרומוזומלית, אנטיגן לוקיציט אנושי (hla) סרולוגית הקלדה, מגבלת אורך קטע ההגבלה, מספר משתנה של הטנדם חוזר, גנוטיפ מיקרולוווין, הזרמת cy, ו p57 KIP2 אימונוהיסטוכימיה. זה איפשר חלוקה מדויקת של התפיסות HM מבוסס על תרומת הורים כדי genomes שלהם, כדלקמן: CHM, אשר דיפלואידי דמוי מונוספרמיק או דיפלואידי אנדרוגנטי, ו phm, אשר הם triploid, מפזרים ב 99% ו מונוספרמיק ב 1% מהמקרים5,6,7,8. יתר על כן, יש עוד סוג של גנוטיפ של HM אשר התפתחה בשני העשורים האחרונים, אשר הוא דיפלואידי biparental ורים. האחרון הוא בעיקר וחוזר ועלול להשפיע על בן משפחה בודד (במקרים משפחתיים) או לפחות שני בני משפחה. אלה דיפלואידי הורים שומות נגרמות בעיקר על ידי מוטציות רצסיבי ב NLRP7 או KHDC3L בחולים9,10,11,12. Diploid ביורית HM בחולים עם מוטציות רצוניות ב NLRP7 ניתן לאבחן כמו CHM או phm על ידי ניתוח מורפולוגית וזה נראה קשור לחומרת המוטציות בחולים13,14. בנוסף לסיווג של HM על פי הגנוטיפים שלהם, המבוא והשימוש של מספר שיטות גנוסטי מותר את ההבחנה של ישויות טוחנת שונות מפני הפלות שאינן מולרי, כגון תפיסות הורים ו תפיסות מסוגים אחרים5,15. תפיסות כאלה אולי יש כמה התפשטות trophoblast פיצוץ ומורפולוגיה villous חריגים המחקים, במידה מסוימת, כמה תכונות מורפולוגיות של HM.
המטרה של מאמר זה היא לספק פרוטוקולים מפורטים עבור מולטיפלקס וזרימה cy, לזרום עם הרקמה הקבועה של הפרפין-מוטבע (FFPE) רקמות, וניתוחים מקיפים של תוצאות שיטות אלה ושילובם עם שיטות אחרות עבור אבחנה נכונה וחותכת של רקמות טוחנת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD FACS Canto II</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>338960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer</td>
			<td>Applied biosystems</td>
			<td>313001R</td>
			<td>Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60, histopathology mounting medium</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23244257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y stock solution (1%)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SE23-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCSalyzer - flow cytometry analysis software</td>
			<td>SourceForge</td>
			<td>-</td>
			<td>https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FFPE Qiagen kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td>For sectioning and for the cleaning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (Concentrated)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6283-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips: Cover Glass</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-541a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CS401-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4311320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC platform: Benchmark Ultra</td>
			<td>Roche</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>30-34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex filtering mesh, 48 microns</td>
			<td>Filmar</td>
			<td>74011</td>
			<td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&#38;id=51&#38;lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p57 antibody</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>457M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53499-632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td>
			<td>GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PeakScanner 1.0</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4381867</td>
			<td>Software for genotyping analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPlex 16 HS System</td>
			<td>Promega Corporation</td>
			<td>DC2102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation matrix: POP-7 Polymer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4352759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microsatellite dna genotyping and flow cytometry ploidy analyses of formalin-fixed paraffin-embedded hydatidiform molar tissues

Hydatidiform שומה (HM) הוא הריון אנושי נורמלי מאופיין התפשטות trophoblastic מוגזמת ופיתוח עובריים חריגים. ישנם שני סוגים של HM מבוסס על הערכה מורפולוגית מיקרוסקופית, להשלים HM (CHM) חלקי HM (PHM). אלה יכולים להיות מחולקת עוד יותר על בסיס תרומת הורים הגנום הטוחנת. אפיון כזה של HM, לפי מורפולוגיה וניתוחי גנוטיפ, הוא חיוני לניהול המטופלים ולהבנה הבסיסית של הפתולוגיה הזאת מעניינת. זה מתועד היטב כי ניתוח מורפולוגית של HM הוא כפוף השונות הבינמתבונן רחב והוא לא מספיק על עצמו כדי לסווג במדויק HM לתוך CHM ו PHM ולהבדיל אותם מפני הפלות הלא טוחנת הידרופית. ניתוח הקלדה מבוצע בעיקר ב-DNA ורקמות מ-formalin קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) מוצרים של תפיסה, אשר יש פחות מאשר איכות אופטימלית ולכן עלול להוביל למסקנות שגויות. במאמר זה, פרוטוקולים מפורטים עבור מולטיטפלקס והזרמת cy, ניתוח הרקמות הטוחנת של FFPE מסופקים, יחד עם הפרשנות של תוצאות שיטות אלה, פתרון בעיות שלהם, אינטגרציה עם הערכה מורפולוגית , p57KIP2 אימונוהיסטוכימיה, ו זריחה באתרו היברידיזציה (דג) כדי להגיע לאבחנה נכונה ואיתנה. כאן, המחברים חולקים את השיטות והלקחים שנלמדו במהלך 10 השנים האחרונות מהניתוח של כ 400 מוצרים של ההתעברות.

המורכבות של רקמות טוחנת והעובדה כי יש להם גנוטיפים שונים מחייב ניתוח קפדני ושימוש בשיטות מסוימות כגון הערכה מורפולוגית, p57 אימונוהיסטוכימיה, גנוזה מיקרולווין, זרימה cy, ודגים. לדוגמה, מטופל אחד (1790) הופנה עם שני PHM שנמצאו להיות triploid על ידי ניתוח microarray של POCs בלבד. המטופל אובח?...

Watch this Scientific Journal Video about Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues at JoVE.com

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

שומות hydatidiform הם הריונות אנושיים חריגים עם aetiologies הטרוגנית שניתן סיווג על פי תכונות מורפולוגיות שלהם תרומת הורים הגנום הטוחנת. כאן, פרוטוקולים של הננו-DNA מיקרולוווין של דנ א וזרימה cy, הרקמה הקבועה של formalin-מוטבע הרקמות הטוחנת מתוארים בפרוטרוט, יחד עם התוצאות ' פרשנות ואינטגרציה.

דנ א של מיקרולוווין הגנוזות וזרימה Cy, בדיקות פלוטודיה של פורמאלין-קבוע פרפין-מוטבע רקמות טוחנת

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

היתרון העיקרי של פרוטוקול genotyping שלנו הוא שזה ממזער זיהום עם DNA אימהי, שהוא האתגר העיקרי כאשר genotyping פורמלין קבוע, פרפין מוטבע רקמות טוחנות. ציטומטריית זרימה היא שיטה מהירה וזולה המאפשרת מאוד את האבחנה של שומות hydatidiform. עבור כל פרפין קבוע פורמלין מוטבע, או FFPE, תוצר של התעברות, להכין ארבעה מיקרון עבה hematoxylin וכתם אאוסין סעיף כמפורט בסרטון זה להערכה מורפולוגית על ידי מיקרוסקופיה.מניחים את גושי FFPE על קרח במשך 15 דקות כדי להקל על הסעיף. התאימו את המיקרוטום לחתוך חלקים בעובי ארבעה מיקרון להערכה מורפולוגית מיקרוסקופית. מניחים את הבלוק הקר במיקרוטום וחותכים קטע אחד מכל בלוק עבור כתמי H&E.באמצעות מדפים, להעביר כל קטע לאמבט מים 45 מעלות צלזיוס. לאסוף את החלק מן אמבט המים עם שקופית טעונה חיובית בעבר שכותרתו עם מספר זיהוי מדגם באמצעות עיפרון. מניחים את השקופיות המכילות את החלקים בתנור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחלקים לדבוק בשקופיות.שמור את השקופיות בתנור במשך 25 דקות. בצע את הכתם של H&E על-ידי טביעת השקופיות בצנצנות הכתמים המתאימות למשך פרק הזמן הנכון כפי שהוא טבלאי בפרוטוקול הטקסט. הר את מקטעי ארבעת המיקרונים לניתוח מורפולוגי עם מדיום הרכבה.ולכסות עם פתקי כיסוי זכוכית. באמצעות שקופיות H&E ומיקרוסקופ אור, בחר את בלוק FFPE הכולל את הכמות הגדולה ביותר של villi כוריוני. ואם אפשר, הבלוק שיש לו וילי כוריוני נפרד ולא התערבבו עם רקמות אימהיות.התאימו את המיקרוטום לחתוך חלקים בעובי 10 מיקרון להפקת דנ"א. לחתוך 10 עד 30 חלקים, בהתאם לכמות של villi כוריוני בבלוק. לאחר איסוף המקטעים עם שקופיות כבעבר, מקם את השקופיות המכילות את המקטעים בתנור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למקטעים לדבוק בשקופיות.שומרים את השקופיות בתנור למשך 20 דקות. בצע את הכתם של H&E על-ידי טביעת השקופיות בצנצנות הכתמים המתאימות למשך פרק הזמן הנכון כפי שהוא טבלאי בפרוטוקול הטקסט. השאירו את השקופיות מתחת למכסה המנוע של האדים למשך שלוש שעות לפחות על מנת שריחות הקסילן הרעילים יתפוגגו.בעזרת מדפים, קורעים חתיכת נייר זעירה מנגב נייר לח. תחת מיקרוסקופ סטריאו קל, השתמש במקלפים ובחתיכות קטנות של מגבוני נייר לחים במים כדי לגרד את כל הרקמות האימהיות הלא רצויות מכתמי H&E בעובי 10 מיקרון. המפתח לצעד זה הוא סבלנות, במיוחד עבור בלוקים מאתגרים.חשוב גם שמישהו אחר יסתכל כדי להבטיח שלא יחסרו רקמות אימהיות. עכשיו, לקרוע פיסת נייר חדשה מתוך מגבוני נייר לחים ולהשתמש בו כדי לאסוף את villi כוריוני. מניחים את חתיכות מגבוני נייר עם villi כוריוני המצורף שלהם לתוך צינור שכותרתו 1.5 מ"ל.למזער את כמות מגבוני נייר המשמשים בשלב זה כמו יותר מדי עלול לסתום את עמודת החילוץ DNA וכתוצאה מכך להפחית את הכמות הסופית של DNA שנאסף. בצע את פרוטוקול מיצוי ה-DNA מערכת FFPE כדי לבצע מיצוי DNA. באמצעות ספקטרופוטומטר מעבדה, לטעון 1 מיקרוליטר של DNA ולמדוד ספיגה ב 216 ננומטר לכימות.לטעון 1 microliter של DNA על ג'ל 2%agarose ולהפעיל אלקטרופורזה ג'ל במתח של 80 עד 100 וולט להערכה איכותית. בהתבסס על תוצאות הערכת ה- DNA, בחר את נפח ה- DNA שישמש בהגברת PCR חוזרת דו-מושבית קצרה מולטיפלקס. כוונו להשתמש במינימום של 1000 ננוגרם דנ"א.המשך להגברת PCR, אלקטרופורזה נימית וניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבחור את בלוק FFPE האידיאלי, השתמש בשקופיות H&E במיקרוסקופ אור כדי לבחור בלוק FFPE שיש לו בערך 50 עד 70% מהרקמות שלו המורכבות מווילי כוריוני. עבור בלוקים כי אין את הכמות האידיאלית של villi כוריוני, להעשיר עבור villi כוריוני כמו הסעיף מבוצע.כדי לעשות זאת, לזהות איזה צד של החלקים לחתוך טרי מכיל villi כוריוני יותר על פי שקופית H&E המתאימה שלה. לאחר מכן, השתמש בלהב כדי לחתוך את החצי השני כי צריך להיות מושלך על מנת להעשיר עבור villi כוריוני. כדי לבצע חתך של בלוק FFPE הטוב ביותר האפשרי, לחתוך ארבעה חלקים כי הם 50 מיקרון עבה באמצעות microtome.במקרה זה בלוק FFPE אידיאלי אינו זמין, שואפים לשמור על היחס של villi כוריוני לרקמה אימהית בכל זאת. לדוגמה, אם רק 30% מהבלוק מורכב מווילי כוריוני, בעוד שלשאר יש רקמות אימהיות, הסר לפחות מחצית מהקטע המכיל את הרקמות האימהיות, ולהשתמש במקטעים נוספים כדי לפצות. מניחים את החלקים בצינורות 15 מ"ל שכותרתו.עבור deparaffinization ו rehydration, לעבוד במכסה המנוע אדים כדי להוסיף כל reagent ולחכות את פרק הזמן המתאים כפי בטבלה בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להסיר את reagent על ידי יניקה ואקום עם פיפטה פסטר. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מעלות צלזיוס ציטראט פתרון צינורות 15 מ"ל.לאחר הנחת 80 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעתיים, לתת את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר. הסר את פתרון ציטראט על ידי שאיבת ואקום. מוסיפים שישה מיליליטר של 1x PBS, מערבולת, ולחכות 1-2 דקות כדי לאפשר את הרקמות להתיישב לתחתית.במידת הצורך, צנטריפוגה הדגימות ב 1000 סל"ד במשך 30 שניות. הסר את PBS 1X על ידי שאיבה ואקום. עכשיו להוסיף מ"ל אחד של פתרון פפסין שחומם מראש ומ מניחים באמבטיה יבשה 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.וורטקס כל 10 דקות. הכינו את פרופידיום יודיד ריבונוקלאז פתרון ב -10 הדקות האחרונות של הדגירה הזו. הוסף עוד שישה מ"ל של 1x PBS, מערבולת, ולחכות 1 עד 2 דקות כדי לאפשר את הרקמות להתיישב לתחתית.שוב, להסיר את PBS 1x על ידי שאיבה ואקום. מוסיפים 550 מיקרוליטרים של הפרופידיום יודיד ריבונוקלאז A פתרון, ומ מניחים את הדגימות באמבטיה יבשה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. השתמש מדחפים למקם חתיכה חמישה ס"מ על חמישה ס"מ של רשת סינון 48 מיקרון בחלק העליון של צינורות תחתונים עגולים פוליסטירן לשימוש עם ציטומטר זרימה.סנן את הפתרון על ידי צינור הנוזל דרך רשת לתוך הצינור. הדגימות מוכנות כעת לפעולה על ציטומטר הזרימה. שמור אותם עטופים בנייר כסף עד שהם מוכנים לרוץ.לבסוף, בצע ציטומטריית זרימה וניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מיקרוסטליט genotyping של שומה hydatidiform חלקית, יחד עם ה-DNA של המטופל ובן זוגה, מגלה כי השומה של המטופל הוא דיספרמי triploid. הסמן הראשון מציג שתי פסגות במוצר ההתעברות.השיא הראשון מקורו באם, שכן רק לאם יש שיא בגודל כזה. בעקבות אותה נימוק, הפסגה השנייה מקורה באב, שכן הוא חולק את אותו אלל. שים לב איך הפסגה השנייה היא הרבה יותר גבוהה מאשר הראשון, המציין כי יש כנראה שתי מנות של אלל אבהי אותו בשיא זה.זיהום אימהי הוא מינימלי מאוד במוצר זה של התעברות כי זה מציג שיא זעיר מאוד במיקום של אלל אימהי השני. הסמן השני מראה שלוש פסגות במוצר ההתעברות. שתיים מהפסגות הללו מקורן באב, אחת מהאם.הסמן השלישי והרביעי דומים לסמן הראשון, וגם מראים שני אללים שמגיעים מהאב, ואחד מהאם. מכיוון שכל ארבעת סמנים מראים באופן עקבי שלושה אללים, שניים שמקורם באב ואחד מהאם, ניתן להסיק כי תוצר זה של התעברות הוא דיספרמי טריפלואיד ומאשר את האבחנה של שומה חלקית. לפרשנות של תוצאות genotyping, חשוב להיות מודעים לרמת הזיהום בהתבסס על ההערות שנלקחו במהלך שלבי הניקוי.במקרים מסוימים, אין באפשרותנו להגיע למסקנה בהתאם לשתי שיטות אלה. במקרים כאלה, אנו משתמשים בשיטות אחרות כגון FISH, כדי לחשוף את הגנוטיפים האמיתיים. Microsatellite genotyping אפשרה אבחון טוחן מדויק וסללה את הדרך להבין טוב יותר את הגנוטיפים הקשורים לתכונות השונות של שומות hydatidiform.

Research

JoVE Journal

Genetics

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

ברזולוציה גבוהה ההיתוך PCR עבור המשלים קולטן 1 אורך פולימורפיזם גנוטיפינג: כלי חדשני למחלת אלצהיימר הערכת רגישות גנים

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

מדידה של מחוז בקרת וירוס BK-פוליפוניים שאינו קידוד מונחה פעילות באמצעות הזרמת שפות

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...